迷迭香提取物對小鼠學習記憶能力的影響

向安萍 馮華 滕淑靜 宋旭日

迷迭香[1]（Rosmarinus officinalis L.）是一種唇形科迷迭香屬植物，全草可入藥，味辛性溫，具有健胃、安神的功效。早在2000多年前的歐洲，迷迭香被用來增強記憶力、改善語言障礙；飲用迷迭香茶可提神醒腦，提高注意力。本實驗擬研究迷迭香提取物對小鼠學習記憶能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供的昆明種小鼠180只，雌雄各半，清潔級，平均體質量（20±3）g。

1.1.2 藥物與主要試劑 迷迭香由平江香草公司提供，采用水蒸氣蒸餾和溶劑萃取法[2]制備迷迭香精油、迷迭香水溶性提取物和迷迭香脂溶性提取物；氫溴酸東莨菪堿注射液（上海禾豐制藥有限公司），規格為1ml: 0.3mg；鹽酸吡硫醇片（腦復新，上海新亞藥業有限公司）；生理鹽水（貴州天地藥業有限責任公司）。

1.1.3 儀器 DT- 200跳臺自動測試儀（上海益聯科教設備有限公司）、ZH-500x型小鼠避暗儀（安徽正華生物儀器設備有限公司）；BW- MYM103型Y迷宮（上海軟隆科技發展有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 小鼠適應性飼養1周，隨機分為3組，每組60只，準備分別用于跳臺實驗、避暗實驗和Y迷宮實驗。每組60只小鼠隨機分為空白對照組、模型組、陽性藥組及迷迭香精油組、水溶性提取物組和脂溶性提取物組（n=10）。

1.2.2 給藥 各組在實驗前均進行6d的適應性訓練，第7天給藥：空白對照組和模型組給予等體積的生理鹽水，陽性藥組灌胃腦復新100mg/kg，試藥組分別灌胃迷迭香精油、水溶性提取物和脂溶性提取物200mg/kg，連續14d；末次給藥后1h除空白對照組腹腔注射等量的生理鹽水，其余各試驗組均腹腔注射東莨菪堿3mg/kg[3]，20min后進行各項實驗。

1.2.3 跳臺實驗 將小鼠先放入反應箱內適應3min，然后通36V交流電。動物在受到電擊時的正常反應是跳回平臺從而躲避傷害性刺激。但多數動物可能再次或多次跳下平臺到銅柵上，受電擊后又快速跳回平臺。記錄小鼠受到電擊的次數即為錯誤次數，如此訓練5min，作為學習成績。24h后再進行測試，記錄小鼠第一次跳下平臺的時間即為潛伏期和5min內的錯誤次數。

1.2.4 避暗實驗 將小鼠放入避暗儀的明室，明暗室間的圓洞打開，讓小鼠自由穿梭于明暗室適應3min；測試時暗室通電（36V），小鼠背對洞口放入明室，進入暗室受到電擊，正常反應為返回明室，反復訓練5min。24h后再測試，記錄進入暗室潛伏期和5min內的錯誤次數。

1.2.5 Y迷宮實驗 Y迷宮有3個支臂和一個連接區，每臂均可通電源，不通電的支臂為安全區，其他兩支臂則通電為非安全區，安全區與非安全區可隨機改變。將小鼠放于起步區（未通電）適應3min，然后通電變換安全區；每當小鼠到達安全區30s后再隨機改變安全區的位置，轉變5s后非安全區底部通電，刺激小鼠足底而驅使其跑向安全臂。小鼠在10s內從非安全區一次性跑向安全區即被判為正確，否則均判為錯誤。以10次測試中正確的次數作為小鼠學習記憶的成績。

1.2.6 統計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行統計分析，實驗數據以±s表示，樣本均數比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 對小鼠跳臺學習記憶能力的影響 如表1所示，模型組的跳臺學習成績和記憶成績較空白對照組明顯下降，說明建成了記憶障礙模型。與模型組比較，陽性藥組、迷迭香精油組、水溶性提取物組和脂溶性提取物組使小鼠跳臺學習成績和記憶成績明顯提高（P＜0.01）。

表1 迷迭香提取物對小鼠跳臺成績的影響（±s，n=10）

注：與空白對照組比，*P＜0.01，#P＜0.05；與模型組比，**P＜0.01

組別 學習成績（5min錯誤次數）記憶成績潛伏期（s） 5min錯誤次數空白對照組 3.0±0.3 236.9±6.3 2.1±0.2模型組 4.6±0.4* 187.8±5.2* 3.0±0.4#陽性藥組 2.9±0.3** 240.4±7.9** 1.9±0.2**迷迭香提取物精油組 3.1±0.2** 235.7±10.0** 1.7±0.2**水溶性組 2.7±0.3** 256.2±8.9** 1.2±0.2**脂溶性組 2.9±0.4** 253.9±7.6** 1.3±0.2**

2.2 對小鼠避暗學習記憶能力的影響 模型組的避暗實驗潛伏期較空白對照組縮短，錯誤次數增加，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組、迷迭香精油組、水溶性提取物組和脂溶性提取物組的避暗潛伏期延長，錯誤次數減少，差異具有統計學意義（P＜0.01），見表 2。

2.3 對小鼠Y迷宮學習記憶能力的影響 如表2所示，模型組的Y迷宮實驗正確次數較空白對照組減少，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組、迷迭香精油組、水溶性提取物組和脂溶性提取物組Y迷宮10次實驗的正確次數均有提高，差異具有統計學意義（P＜0.01）。

表2 迷迭香提取物對小鼠避暗和Y迷宮成績的影響（±s，n=10）

表2 迷迭香提取物對小鼠避暗和Y迷宮成績的影響（±s，n=10）

注：與空白對照組比*P＜0.01；與模型組比，**P＜0.01

組別避暗實驗 Y迷宮（10次實驗的正確次數）潛伏期（s） 5min錯誤次數空白對照組 234.0±6.2 1.0±0.3 7.8±0.4模型組 183.4±5.3* 2.4±0.4* 4.2±0.4*陽性藥組 213.4±8.0** 1.0±0.3** 6.8±0.4**迷迭香提取物精油組 206.8±2.0** 1.2±0.2** 7.0±0.5**水溶性組 221.4±2.7** 0.6±0.2** 7.4±0.8**脂溶性組 219.4±3.9** 0.8±0.2** 7.2±0.5**

3 討論

學習記憶是中樞神經系統的高級思維活動，是由乙酰膽堿（Acetylcholine,Ach）、5-羥色胺（5-Hydroxytryptamine,5-HT）、γ-氨 基 丁 酸（γ-ami nobutyric acid ,GABA）等多種神經遞質參與的復雜的神經生理活動[3]。Ach作為中樞膽堿能神經末梢釋放的重要化學遞質，通過與膽堿受體結合，興奮膽堿能系統，調節第一級記憶向第二級記憶的轉移過程，是促進學習記憶的神經遞質。東莨菪堿是M膽堿受體阻斷藥，通過阻斷Ach與M受體的結合，影響乙酰膽堿介導的記憶功能。本實驗用東莨菪堿建立記憶障礙模型，研究迷迭香提取物對小鼠學習記憶能力的影響，結果顯示：東莨菪堿記憶障礙模型構建成功，迷迭香精油組、水溶性提取物組和脂溶性提取物組均可改善記憶障礙模型小鼠的學習、記憶能力。

Ach的生物合成以膽堿和乙酰輔酶A為原料，在膽堿乙酰化酶（Choline acetyltransferase, ChAT）的催化下合成。Ach在乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AchE）的作用下分解為膽堿和乙酸而失活。ChAT和AchE共同作用調節著Ach含量的動態平衡。東莨菪堿所致記憶障礙模型小鼠腦組織的Ach含量降低、AchE活性增高、ChAT活性降低，而降低AchE活性、增強ChAT活性、增加腦內Ach含量可提高小鼠的學習記憶能力[4，5]。Ach作為神經遞質儲存在膽堿能神經末梢突觸的囊泡內，神經沖動產生時釋放到突觸間隙以發揮作用。但是，Ach的釋放需要突觸素（synaptophysin，SYP）及其他囊泡蛋白的調節。SYP是一種突觸囊泡鈣結合蛋白，通過與Ca2+結合、促使囊泡與突觸前膜融合并開啟融合孔，引起囊泡內Ca2+依賴性神經遞質如Ach的釋放[6]。研究顯示，若突觸素表達減少或缺失，Ach不能釋放，導致突觸信息傳遞障礙，引起記憶力下降[7]。因此，迷迭香提取物提高東莨菪堿所致記憶障礙模型小鼠的學習記憶能力的作用機制是增加Ach含量還是調節Ach的釋放還有待進一步研究。

另外，迷迭香精油、水溶性提取物、脂溶性提取物均含有多種成分，其中迷迭香提取物油溶性有效成分主要為鼠尾草酸和水溶性有效成分主要為迷迭香酸。研究表明[8，9]，鼠尾草酸和迷迭香酸均有抗氧化作用，可抑制活性氧（reactive oxygen species,ROS）的產生，顯著提高衰老小鼠機體抗氧化酶活性，降低機體的氧化負荷，減輕過氧化脂質的產生，有效延緩衰老。可見，迷迭香提取物對學習記憶能力的影響是某一活性成分的獨立效應還是多種成分的聯合效應，是單一作用機制還是多種作用機制，還有待實驗研究論證。