海南省氣候對“候鳥”高血壓患者炎性因子和miR-146a的短期影響

朱連榮，彭志晴，劉文徽，李楠，藍云鋒，賈國棟

方法：共納入90例研究對象，其中高血壓組60例和正常對照組30例。測量并記錄兩組人群初到海南1周內、1個月和3個月后的血壓情況，比較兩組人群的血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β以及PBMC內miR-146a基因的表達情況。

結果：與1周內相比，高血壓患者1個月和3個月收縮壓和舒張壓明顯降低（P均＜0.05），TNF-α、IL-1β和IL-6水平以及miR-146a基因表達也明顯下調（P＜0.05）。miR-146a基因與TNF-α、IL-1β呈顯著正相關（P＜0.05），而與IL-6無顯著相關性（P＞0.05）。正常對照組的血壓水平、血清炎性因子濃度和miR-146a基因表達在三個時間段無明顯差異。

結論：高血壓患者在海南居住1個月后血壓改善，可能與TNF-α、IL-1β和IL-6水平以及miR-146a基因表達降低有關。

高血壓病是多系統、多因素綜合作用的結果，越來越多的研究資料顯示高血壓常伴隨著免疫功能異常，單核細胞是慢性炎癥的重要參與者[1]，分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）[2]、白細胞介素6 （IL-6）[3]和白細胞介素1（IL-1β）[4]在內的多種細胞因子和趨化因子[1，5]，這些炎性因子在高血壓發生、發展中起重要的作用[6]。近年的研究提示，微小RNA （miR）在心血管系統疾病的發生、發展過程中起了重要作用，TNF-α和IL-1β刺激單核細胞后， 可以通過核轉錄因子（NF）-κB方式誘導miR-146a基因表達[7]?！昂蝤B”人群是指以追求高質量的生活為目標，以氣候為基礎的短期季節性遷徙的人群，其生活方式、疾病類型和醫療需求與海南常住人口有明顯差異。本研究旨在了解海南地區“候鳥”高血壓患者的血壓改善情況，并探討外周血單核細胞（PBMC）內miR-146a基因的表達與血清TNF-α、IL-6和 IL-1β水平的相關性。

1 資料與方法

研究對象：采集2014-10至2015-03期間在解放軍總醫院海南分院就診的單純高血壓患者以及健康查體者。納入標準為：（1）海南省戶籍以外，男女不限，年齡≥40歲；（2）初次到達海南島，入島時間在7天以內；（3）單純高血壓患者已服藥治療；（4）計劃在海南生活時間≥6個月；（5）經體檢除外感染、腫瘤、免疫系統缺陷、嚴重肝腎功能不全等疾病以及應用炎癥抑制藥物者；（6）高血壓患者入組后服用降壓藥和（或）其他藥物與入組前相比未做改變。能定期監測血壓，按時隨訪。入選對象均經解放軍總醫院海南分院醫學倫理委員會批準，并與本人簽署知情同意書。

分組：高血壓組：選擇冬季遷徙居住在海南地區的“候鳥”人群中在我院住院和門診隨診的原發性高血壓患者60例（男性37例，女性23例），平均年齡（59.9 ±11.2）歲。符合2010年《中國高血壓防治指南》高血壓診斷標準[8]。正常對照組：選擇同期年齡、性別相匹配的在本院門診體檢的健康“候鳥”人群30例（男性16例，女性14例），平均年齡（54.5±7.9）歲；其血壓水平從未發現異常，收縮壓和舒張壓長期分別在 90～140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）和60～90 mmHg之間。

研究方法：按照“候鳥”人群居住時間分為四個時期：1期：初到海南1周內；2期：到海南1個月；3期：到海南3個月；4期：到海南4～6個月（由于4期失訪率超過40%，故未納入統計）?！昂蝤B”人群在到達海南1周內、1個月和3個月時共測量三次血壓水平。

實驗室檢查：血清TNF-α、IL-6 和IL-1β的水平測定采用酶聯免疫吸附法（ELISA），檢測方法嚴格按照說明書步驟由課題組同一人完成。采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離PBMC，實時定量多聚酶鏈式反應（Real-time PCR）法檢測PBMC內miR-146a的表達。分離的PBMC，用一步法多聚酶鏈式反應（PCR）提取細胞總RNA。提取的RNA經電泳鑒定未被降解， 再用72-1分光光度計測260 nm和280 nm范圍的吸光度值A260 和 A280，所有樣品的A260/A280比值介于1.9～2.1 。根據A260對樣品的總RNA進行初步定量。用TaKaRa實時定量試劑盒配置25 μl反應體系。采用miScript Reverse Transcription試劑盒進行逆轉錄反應，取5 μl cDNA模板采用mi Script Primer assay 和mi Script SYBR Green PCR試劑盒進行PCR。miR-146a 基因擴增應用miScript通用引物及其各自炎性指標特異性引物，同時以5S作為內參，最終在ABI 7500 Real-time PCR儀測定其相對表達量。上述試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司， 具體操作步驟均按照說明書進行。

統計學方法：使用 SPSS 19.0軟件包對數據進行統計學分析，計量資料以±s表示，數據類型符合正態分布數據，進行比較采用單因素重復測量方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

兩組受試者的一般臨床資料及血壓水平比較（表1）：高血壓組和正常對照組性別和年齡比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。高血壓組中，與 1期比較，患者在2期和3期時的血壓明顯下降，差異均有統計學意義（P均 ＜0.05），與2期比較，3期時的血壓雖有所下降，但差異無統計學意義（P＞0.05）。正常對照組的血壓平穩，三個時間段的血壓差異均無統計學意義（P均 ＞0.05）。

表1 兩組受試者的一般臨床資料及血壓水平比較（±s）

表1 兩組受試者的一般臨床資料及血壓水平比較（±s）

注：與同組1期比較*P＜0.05。1 mmHg=0.133 kPa

候鳥人群居住時間1期 (1周內) 2期 (1個月) 3期 (3個月)收縮壓 (mmHg) 舒張壓 (mmHg)收縮壓 (mmHg)舒張壓 (mmHg) 收縮壓 (mmHg) 舒張壓 (mmHg)正常對照組 30 16/14 54.5±7.9 121.0±6.6 67.0±8.4 122.0±9.3 66.0±7.4 118.0±10.1 68.0±4.9高血壓組 60 37/23 59.9±11.2 144.0±17.2 82.0±8.9 130.0±14.6 * 68.0±7.3 * 126.0±31.4 * 67.0±5.6 *分組 例數 男/女 (例) 年齡 (歲)

兩組受試者血清炎性因子水平比較（表2）：（1）與正常對照組比較，高血壓組1期～3期的血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平均較高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（2）在高血壓組患者中，與1期比較，2期和3期的血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（3）正常對照組中，三個時間段的血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平變化差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 兩組受試者的炎性因子水平比較（±s）

表2 兩組受試者的炎性因子水平比較（±s）

注：TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-6：白細胞介素6；IL-1β：白細胞介素1β。與同期正常對照組比 *P＜0.05；與高血壓組I期比△P＜0.05

候鳥人群居住時間1期 (1周內) 2期 (1個月) 3期 (3個月)正常對照組 (n=30) 高血壓組 (n=60) 正常對照組 (n=30) 高血壓組 (n=60) 正常對照組 (n=30) 高血壓組 (n=60)TNF-α (pg/ml) 1.847±0.09 2.89±0.31* 1.82±0.67 2.45±0.10 * △ 1.78±0.09 2.33±0.17*△IL-1β (ng/ml) 6.61±0.91 10.31±0.55* 4.81±0.21 9.22 ±0.11 * △ 4.64±0.39 8.70±0.75*△IL-6 (pg/ml) 135.12±19.44 277.31±32.89* 129.76±20.11 240.38± 60.43 * △ 131.55±9.12 188.93 ±17.98*△項目

兩組受試者外周血PBMC內miR-146a基因的表達（圖1）：以同時間點正常對照組受試者的PBMC內miR-146a基因表達表示為1，則高血壓組患者在1期、2期和3期時的外周血PBMC內miR-146a基因表達下調，差異均有統計學意義（P均＜0.05），而且隨著時間推移PBMC內miR-146a表達逐漸降低（P均＜0.05）。（2）正常對照組三個時間點的外周血PBMC內miR-146a基因表達隨時間延長有上升趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 兩組受試者外周血單核細胞（PBMC）內 miRNA-146a基因變化

外周血PBMC內miR-146a基因表達及血清炎性因子水平的相關性：miR-146a基因與TNF-α（r=0.601，P=0.012 ）、IL-1β（r=0.583，P=0.034 ）呈正相關（P＜0.05），而與 IL-6（r=0.210，P=0.186 ）無顯著相關性。

3 討論

高血壓人群患病率呈逐年上升趨勢[9]，2010年第六次全國人口普查數據測算高血壓患病人數約為2.7億，主要以藥物治療為主。多項研究從多方面揭示了血清炎性因子與疾病的發生和發展密切相關[5，10-13]，血清炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6等在高血壓的發病機制中可能起重要作用。

本研究結果表明，“候鳥”高血壓人群到達海南1期、2期、3期（1周、1個月及3個月）后血壓呈梯度下降，與到達海南1期血壓比較，2期和3期后的收縮壓和舒張壓均顯著降低（P＜0.05），提示高血壓患者在海南生活1～3個月可改善血壓。海南季節性老年人口遷入使冬季心腦血管意外事件頻發，其中常見心原性猝死，因其發病急、后果嚴重而嚴重危害潛在人群生命健康[14]，本研究發現入島“候鳥”老人存在著血壓變化，為高危人群的早期識別和正確的干預提供了證據。

“候鳥”高血壓組患者到達海南1～3期的血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平均較正常對照組高（P＜0.05），提示高血壓病患者血清炎性因子處于激活狀態，抑制炎性因子的激活可能是治療高血壓的新靶點?！昂蝤B”高血壓人群到達海南1周內的血清TNF-α、IL-1β和IL-6三個炎性因子初始檢測水平較1個月后明顯升高，提示該初始檢測得到的水平可能為高血壓人群的負荷狀態。隨著高血壓組成員到達海南后時間延長，PBMC內miR-146a基因表達隨時間長度呈梯度下調，與三個炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平下降趨勢相仿，提示炎性因子可能是高血壓病的獨立危險因子。

已有研究顯示高血壓患者血清TNF-α水平上升可引起血管內皮損傷[15，16]，當血壓升高時，血管內皮細胞受損及平滑肌細胞增生，均可產生TNF-α。推測TNF-α與血壓水平相互協同，血管內皮長期經受較高的血壓及異常血流的循環會發生損傷，進而激活炎癥反應系統，促使組織和器官產生大量炎性因子；反之，高水平炎性因子所引起的炎癥反應進一步加重內皮細胞損傷，促使血流阻力增加及血管壁彈性降低，使血壓值升高。近年來，我們在臨床實踐中觀察到藥物治療為主，輔以平穩的自然生活環境，對包括高血壓在內的慢性病能夠得到明顯的治療效果。本研究顯示”候鳥”高血壓人群血壓水平與血清中的TNF-α、IL-1β和IL-6三個炎性因子水平呈正相關，隨著高血壓患者血壓水平的降低，其血清中的TNF-α、IL-1β和IL-6三個炎性因子水平也同步下降。本研究從時間和空間的角度比較了高血壓的變化，高血壓患者從內地到海南1周內的TNF-α、IL-1β和IL-6炎性因子水平均處于監測期間最高水平，1個月后的炎性因子水平明顯降低，隨訪期間檢測炎性因子水平與監測血壓水平降低趨勢相仿，3個月后隨訪結束，高血壓患者的血壓和炎性因子均處于隨訪期間最低值，雖然仍高于正常對照組，但血壓的明顯改善使內皮細胞損傷減輕。本研究結果提示海南良好的冬春氣候對高血壓患者康復具有正面效應。

本研究從更年輕的“候鳥”人群中（40～60歲）佐證了前期課題組的結論，即海南“候鳥”老人（＞60歲）的慢性病康復得益于優越的氣候環境[17]。為了進一步驗證結果的可靠性，我們參考miR-146a基因表達調節免疫反應的一項研究[18]，用逆轉錄多聚酶鏈式反應法測定各期miR-146a的表達情況，高血壓組患者到達海南1周、1個月及3個月后的時間里，PBMC 內miR-146a基因表達逐漸下調。隨著監測期間的血壓逐漸降低，炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平的下降，miR-146a基因表達同步減弱，統計學分析顯示miR-146a基因表達與TNF-α和IL-1β水平呈顯著正相關，IL-6雖同步降低，但與miR-146a無相關關系，可能是樣本量較小和（或）實驗誤差的原因。miR-146a基因表達與炎性因子TNF-α和IL-1β呈正相關也進一步從基因角度驗證了連續生活3個月的時間高血壓人群的血壓水平明顯得到改善，也表明基因研究的進展有助于高血壓的臨床診斷和治療[19]。對生活4個月以上的人群血壓我們未能找到足夠樣本進行比較，隨著時間延長，推測這種改善將會持續?！昂蝤B”人群離島后的血壓是否恢復入島時的水平需要進一步研究。海南島是個四季溫差較小的地方[20]，當藥物對病情的控制難以滿意時，自然環境似乎是一個有希望的新途徑[21,22]。