甘薯葉綠原酸的微波協同雙水相提取及其抗氧化活性

蔣益花 蔣新龍

(浙江樹人大學生物與環境工程學院，杭州 310015)

甘薯葉作為甘薯的副產品之一，少部分用作飼料外，加工利用度低，而其中富含綠原酸類化合物[1-2]。

綠原酸是含有羧基和鄰二苯酚羥基的苯丙素類有機酸?，F代醫學與天然產物研究發現，綠原酸在人體中具有顯著的抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抑菌消炎、預防心血管疾病、防曬以及改善認知等功能[3-5]。

目前，綠原酸的提取方法主要有：浸提法[1-2]、微波法[6]、超聲波法[7]、酶解法[8]、超臨界流體萃取法[9]、半仿生提取法[10]、液膜法[11]、索氏提取法[12]等方法。浸提法得率較低，操作時間長，有機溶劑對環境污染大；索氏提取法易出現費時和溶劑用量過大問題；酶解法工藝操作控制較嚴格，因需調節酸堿度易造成部分酚類物質氧化而被破壞；超臨界二氧化碳萃取法綠原酸氧化損失少、提取的產品質量較好、提取效率較高，但設備投資高不適合大規模生產；液膜法產品純度低，膜價格高，過濾速度慢；超聲波輔助提取法簡便快捷、提取溫度低、時間短、得率高，但獲得產品純度不高；半仿生提取法產品純度低。雙水相萃取是根據組分在兩相間的選擇性分配而達到目標成分分離的目的[13]，因其操作條件較溫和、分離過程可控、操作簡單等優點，所以易于工業放大；尤其適用于具有生物活性的生物物質的分離和提純[13]。目前，雙水相體系用于綠原酸分離純化的研究報道較多[14-15]，但直接用于提取綠原酸的極少。本研究排除成本高、體系黏度大、回收難的高聚物雙水相體系，直接用有機溶劑水溶液和一定量的無機鹽配成雙水相體系作為提取劑進行微波協同提取綠原酸，并考察了所提取甘薯葉綠原酸的抗氧化活性，為甘薯葉資源化開發利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅心番薯葉[red.fleshIpomoeabatatas(L.)Lam.leaves]于2016年4月上旬采自浙江省諸暨市次塢鎮種植地。將采摘的新鮮甘薯葉除去泥沙、黃葉等，再用清水漂洗干凈，50 ℃鼓風干燥72 h，粉碎過60目篩，放入自封袋中，置于干燥器中備用。綠原酸標準品購于中國藥品生物制品檢定所；所用其他試劑均為國產分析純；所用水為蒸餾水。

D8017Tl-2H型格蘭仕微波爐；7220型分光光度計；GZX-91400MBE電熱恒溫鼓風干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 綠原酸含量的測定

采用紫外分光光度法測定綠原酸含量[16]。以20 μg/mL的綠原酸為標準溶液制作標準曲線。精密量取1.00、2.50、3.75、5.00、6.25 mL綠原酸標準溶液，放置于10 mL容量瓶中，用75%乙醇定容，將綠原酸標準對照品配制成2.0、5.0、7.5、10.0、12.5 μg/mL 5個質量濃度的溶液，在329 nm波長下測定其吸光度A。以綠原酸質量濃度C(μg/mL)作橫軸，吸光度A為縱坐標繪制標準曲線，得到綠原酸質量濃度C(μg/mL) 與吸光度A之間的回歸方程為：A=0.053 1C+0.013 02，線性范圍0～12.5 μg/mL，相關系數R2=0.999 9。吸取甘薯葉粗提液適量，同法測定其吸光值，根據回歸方程計算綠原酸含量。

式中：C為回歸方程計算所得值；V為粗提液總體積。

1.2.2 微波協同雙水相體系提取工藝實驗

提取方法：稱取0.500 0 g甘薯葉粉末樣品于500 mL燒杯中，加入一定體積的有機溶劑溶液和一定質量的無機鹽，在一定微波功率條件下微波處理一定時間，趁熱抽濾得濾液。靜置5 min，待其分層，收集上清液，得到甘薯葉綠原酸粗提液(Sweet Potato Leaf Chlorogenic acid extract，SCE)，測定綠原酸含量。

單因素實驗：稱取0.500 0 g紅薯葉粉末樣品，按照1.2.2方法對綠原酸提取過程中的乙醇體積分數、磷酸氫二鉀用量、提取時間、液料比和微波功率五因素分別進行水平篩選及優化。設置液料比100∶1(V/m)，50%的乙醇溶液，微波功率320 W提取時間30 s，考察析相鹽磷酸氫二鉀用量(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 g)對綠原酸得率的影響；設置液料比100∶1(V/m)，磷酸氫二鉀5.0 g，微波功率320 W提取時間30 s，考察有機相乙醇體積分數(30%、40%、50%、60%、70%)對綠原酸得率的影響；設置50%的乙醇溶液，磷酸氫二鉀5.0 g，微波功率320 W提取時間30 s，考察液料比(40∶1、60∶1、80∶1、100∶1、120∶1V/m)對綠原酸得率的影響；設置液料比100∶1(V/m)，50%的乙醇溶液，磷酸氫二鉀5.0 g，微波功率320 W，考察提取時間(15、30、45、60、75、90、100 s)對綠原酸得率的影響；設置液料比100∶1(V/m)，50%的乙醇溶液，磷酸氫二鉀5.0 g，提取時間75 s，考察微波功率(160、320、480、640、800 W)對綠原酸得率的影響。

正交優化實驗：在單因素實驗的基礎上，以無機鹽用量為固定值，選取有機溶劑體積分數、液料比、提取時間和微波功率4個因素為自變量，以綠原酸得率為評價指標，利用正交實驗 L9(34)對提取條件進行優化。

1.2.3 抗氧化活性實驗

DPPH·法是用以評價天然抗氧化劑抗氧化活性的一種簡便快速、靈敏可行的方法[17-18]。根據文獻[19]并加以改進，用無水乙醇配制2×10-4mol/L的DPPH·溶液。在10 mL具塞試管中加入2 mL所需濃度(2、4、8、10、16、20 μg/mL)的測定液和2 mL DPPH·溶液，總體積4 mL?；旌暇鶆?，室溫避光反應30 min，以溶劑調零點，測定DPPH·混合溶液在517 nm處的的吸光值A。結果以清除率K表示。

式中：Ai為2 mL DPPH·溶液加入2 mL測定液的吸光度；Aj為2 mL測定液加入2 mL溶劑的吸光度；Ac為2 mL DPPH·溶液添加2 mL溶劑的吸光度。

1.3 統計方法及分析軟件

指標均重復測定3次并取平均值，利用Origin8軟件作圖；應用SPSS20.0軟件進行數據統計，并用Duncan多重比較(SSR法)檢驗各處理平均數之間的差異顯著性(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 雙水相體系的確定

有機溶劑的確定：在離心管中分別加入相同體積的乙醇、丙酮、異丙醇三種有機溶劑，再分別加入定量的磷酸鹽和硫酸銨比較分相情況。結果表明，丙酮、乙醇的分相效果較好。考慮丙酮的毒性較大，所以選擇乙醇作為有機相。

分相鹽的確定：加入相同體積的乙醇溶液，再分別逐量0.5 g遞增地加入等量不同的鹽：硫酸銨、磷酸二氫鉀、無水硫酸鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氯化銨等。置于離心管中比較分相情況。結果表明，在乙醇/水雙水相萃取體系中，磷酸氫二鉀的分相能力強。與其他鹽不分層或難于分層。所以選取磷酸氫二鉀作為分相鹽。

2.2 單因素實驗

2.2.1 磷酸氫二鉀用量的影響

實驗結果見圖1。由于甘薯葉綠原酸屬于苯丙素類有機酸，易溶于弱堿性溶液，磷酸氫二鉀與乙醇形成的雙水相提取劑為弱堿性，有利于甘薯葉綠原酸的溶出。在乙醇-磷酸氫二鉀雙水相中，下相由溶解有磷酸氫二鉀的水及少量乙醇構成，上相則由混有少量水的乙醇構成，易溶于乙醇相的綠原酸提取出后進入上相。雙水相的形成是磷酸氫二鉀與乙醇爭奪水分子的過程。隨著磷酸氫二鉀用量的增加，鹽對水的束縛能力增強，使上相中乙醇的相對體積分數增加[20]。因此，鹽的用量改變可影響到上相的極性，最終影響到綠原酸的得率。由圖1可知，磷酸氫二鉀用量為5.0 g時，綠原酸的得率達到最高值。后續固定磷酸氫二鉀質量濃度100 mg/mL，通過優化調節乙醇體積分數和用量獲得高選擇性雙水相體系。

圖1 甘薯葉綠原酸提取條件單因素實驗結果

2.2.2 乙醇體積分數對綠原酸得率的影響

由圖1可知，在50%時綠原酸的得率達到最高值。這是因為乙醇體積分數直接影響雙水相萃取效果。水量過多無法形成雙水相體系，過少則鹽不能完全溶解；乙醇量太少也無法形成雙水相，太多則會導致鹽的析出。因此，初步確定乙醇最佳體積分數為50%。

2.2.3 液料比對綠原酸得率的影響

由圖1可知，液料比在40～100∶1(V/m)范圍內，綠原酸得率隨著液料比的增加而提高，當液料比高于100∶1(V/m)時，綠原酸得率反而下降，可能是因為當液料比過大時，液體中間部分較難受到微波輻射，只能通過傳統方式受熱，使得傳熱速率下降，導致綠原酸得率下降[21]。因此，控制好一個適當的液料比，會使體系達到一個較好的提取效果，故初步選取最佳液料比為100∶1(V/m)。

2.2.4 提取時間對綠原酸得率的影響

由圖1可知，在75 s時間內，綠原酸得率隨提取時間增加而提高，但提取時間超過75 s時，綠原酸得率不增反降，這主要由于綠原酸中的酚羥基容易被氧化，長時間的微波提取并不能達到很好的提取效果，故初步選取最佳提取時間為75 s。

2.2.5 微波功率對綠原酸得率的影響

由圖1可知，在微波功率為160～800 W范圍內，隨著微波功率的增加，綠原酸得率先增加后減少，在480 W時達到最大值。其主要原因可能是微波功率過高，體系升溫過快，加速了綠原酸的氧化與降解，使粗提液中綠原酸有效濃度下降?？紤]到得率最高，初步選取最佳微波功率為480 W。

2.3 正交設計優化綠原酸提取工藝

以單因素實驗結果為基礎，采用4因素3水平的正交實驗方法，對綠原酸提取工藝參數進行優化，實驗設計和結果見表1，方差分析結果見表2。

表1 正交實驗設計及結果

表2 方差分析表

注：因素C影響小，故作為方差分析的誤差處理；F0.05(2、2)=19.00，*表示因素影響顯著。

表1中K1、K2、K3表示每個因素所進行3次實驗所得的綠原酸得率的平均值。R為平均數的極差，R越大表明變化幅度大，說明該因素的水平變化對綠原酸得率的影響越大，該因素即是最大影響因素。由表1可以看出影響綠原酸得率的因素主次依次排列為：液料比(B)>提取時間(D)>乙醇濃度(A)>微波功率(C)。由表2可以看出，對綠原酸得率的影響液料比(B)顯著，其他都不顯著。直觀分析，實驗的最優水平組合為A1B2C2D2；根據每個因素K1、K2、K3實驗的最優水平組合為A2B2C2D2。Duncan法分析結果表明，乙醇濃度、微波功率三水平之間均無顯著差異。綜合分析提取成本和得率，確定最佳工藝條件A1B2C1D2，即乙醇體積分數40%，液料比100∶1(V/m)，提取時間75 s，微波功率為320 W。

表3 對比實驗結果

注：同列不同字母表示差異顯著P<0.05，下同。

2.4 工藝驗證性實驗

為考察優選微波協同雙水相提取(簡稱：微波雙水相提取，下同)甘薯葉綠原酸工藝的穩定性，稱取甘薯葉0.5000 g，按優化的提取工藝條件進行實驗，即磷酸氫二鉀質量濃度100 mg/mL，40%乙醇溶液，微波功率320 W，微波時間75 s，液料比100∶1(V/m)。重復實驗3次，計算綠原酸得率。同時吸取上層醇溶液，揮干溶劑，制成干浸膏，測定干浸膏中綠原酸的含量。分別精密稱取3份醇提浸膏，配制成一定質量濃度的供試液，測定綠原酸含量。驗證實驗結果，甘薯葉綠原酸得率分別為3.75%、3.73%、3.68%，平均為(3.72±0.036)%。干浸膏中綠原酸的質量分數分別為9.31%、9.40、9.42%，平均為(9.38±0.059)%。實驗結果表明經過正交實驗優選的提取工藝條件穩定，適合規?；a。

2.5 對比實驗

為了進一步研究雙水相提取在得率和純度上的優勢，進行微波提取和微波雙水相提取的對比實驗，實驗條件和結果見表3。實驗結果表明，微波雙水相提取所得得率略小但差異不顯著(P>0.05)，但提取干浸膏中綠原酸的含量提高了2.2倍，說明雙水相提取的純度明顯提高。

2.6 抗氧化性實驗

將甘薯葉綠原酸粗提液(SCE)分別配制成質量濃度為2、4、8、12、16、20 μg/mL的供試品溶液，按照1.2.3方法測定對DPPH·的清除率，并以相同質量濃度的綠原酸、VC作為陽性對照，實驗結果見圖2。根據圖2的量效關系構建實驗濃度和清除率的線性方程，并求出清除率為50%時所需的濃度(IC50)，見表4。表4表明，甘薯葉綠原酸粗提液、綠原酸和VC在實驗濃度范圍內與清除DPPH·自由基呈現出良好的量效關系。SCE清除DPPH·的能力(IC50=(12.29±0.33) μg/mL)強于對照物VC(IC50=(14.64±0.38)μg/mL)和綠原酸(IC50=(16.78±0.55)μg/mL)，SCE比綠原酸和VC對DPPH·的清除效果明顯(P<0.05)。

表4 甘薯葉綠原酸粗提液清除DPPH·自由基的能力

圖2 甘薯葉綠原酸粗提液清除DPPH·自由基的能力

3 討論

本研究使用乙醇、磷酸氫二鉀和水三種綠色材料，組成新型穩定的乙醇-磷酸氫二鉀雙水相萃取體系。研究發現，分相鹽磷酸氫二鉀質量分數過高或有機相乙醇體積分數過高都不利于甘薯葉綠原酸的提取。磷酸氫二鉀質量分數過高，可使上相中乙醇的相對體積分數增加；乙醇體積分數過高，會導致磷酸氫二鉀的析出。雙水相的形成是磷酸氫二鉀與乙醇爭奪水分子的過程[20]。通過優化調整物質組成，可獲得高選擇性萃取體系。實驗結果表明，乙醇-磷酸氫二鉀雙水相萃取體系中，以40%乙醇溶液、磷酸氫二鉀質量濃度100 mg/mL組合為最佳。

本研究根據微波輔助萃取選擇性高、萃取效率高等特點，將雙水相萃取和微波輔助萃取相結合研究微波協同雙水相體系提取甘薯葉綠原酸工藝。在單因素基礎上，通過正交實驗優化了甘薯葉綠原酸工藝。結果表明，液料比對綠原酸得率的影響顯著，液料比是影響綠原酸得率的最主要因素。影響綠原酸得率的因素主次依次排列為：液料比>提取時間>乙醇濃度>微波功率。固定條件磷酸氫二鉀質量濃度100 mg/mL下最佳提取工藝條件為乙醇濃度40%，液料比100∶1(V/m)，提取時間75 s，微波功率為320 W。該工藝條件下得率為(3.72±0.036)%，其干浸膏的綠原酸質量分數為(9.38±0.059)%，而在不加入分相鹽的微波提取條件下得到的甘薯葉綠原酸的得率為(3.86±0.035)%，其干浸膏綠原酸質量分數為(4.23±0.025)%。對比實驗結果表明，加入分相鹽磷酸氫二鉀形成了水相體系，所得得率略小但差異不顯著(P>0.05)，主要是目標物綠原酸進入雙水相體系，表面性質、電荷作用和氫鍵、離子鍵、疏水鍵以及環境等都會對綠原酸的分配造成影響[22]，使得其在上、下兩相中的濃度不同，綠原酸主要集中在本研究萃取的上相，損失了下相綠原酸，所以得率略低于單獨微波提取。對比實驗結果也表明，微波雙水相提取干浸膏中綠原酸的含量明顯提高，純度提高了2.2倍。主要原因是由于分相鹽磷酸氫二鉀的加入，形成了乙醇-磷酸氫二鉀雙水相體系，甘薯葉粉恰好懸浮于兩相之間，易溶于乙醇相的綠原酸提取出后進入上相，易溶于水相的多糖等物質溶于下相。這樣，提取和分離過程同時進行，對甘薯葉粗提液中的綠原酸成分起到了一定的純化、富集作用，這與王曉林等[23]研究結果一致。本研究對比實驗發現，雖然微波雙水相提取所得干浸膏純度有所提高，但與于華忠等[24]純化方法研究結果比較總純度不高，原因是雙水相不具有特異性和專一性[25]，甘薯葉中含有其他的一些易溶于乙醇的物質進入有機相，而導致綠原酸的純度降低，如何進一步純化甘薯葉綠原酸還有待深入研究。本研究的綠原酸得率與其他參考文獻有差異[24]，可能是不同時期采摘、不同品種甘薯的差異所致[26]。

本研究經過新型微波雙水相提取獲得的綠原酸粗提液清除DPPH·的能力強于對照物綠原酸和VC，與李文娜等[27]研究結果一致，甘薯葉粗提液的抗氧化活性與綠原酸含量密切相關。綠原酸粗提液清除DPPH·的能力強于綠原酸，可能是甘薯葉粗提液中黃酮類、酚類等抗氧化物質的存在，強化了其清除DPPH·的能力[28]。

4 結論

對影響甘薯葉綠原酸得率的多個單因素進行分析，并結合正交優化分析，得到微波協同雙水相提取甘薯葉綠原酸的最佳工藝條件為：分相鹽磷酸氫二鉀與有機相乙醇形成乙醇-磷酸氫二鉀雙水相體系，40%乙醇溶液，磷酸氫二鉀質量濃度100 mg/mL，液料比100∶1(V/m)，微波功率320 W，微波時間75 s，此提取條件下甘薯葉綠原酸得率為(3.72±0.036)%。對照微波法提取，微波協同雙水相提取得率略小，所得干浸膏綠原酸的純度明顯提高，雙水相體系起到了一定的純化、富集作用，但總純度仍然不高，如何進一步提高總純度還有待深入研究。甘薯葉綠原酸粗提液清除DPPH·的能力強于對照物綠原酸和VC。微波協同雙水相提取工藝，粗提物純度高，安全便捷，且提取得到的綠原酸粗提物具有較強的抗氧化能力，為甘薯葉的進一步資源化開發利用提供了一定的技術支撐。