食品中苦味物質檢測方法的研究進展

金文苑 胡新中

(陜西師范大學食品工程與營養科學學院，西安 710119)

苦味指由奎寧、咖啡因等物質產生的一種基本味道[1]，普遍存在于食品中。天然毒素幾乎都帶有苦味，出于趨利避害的本能，人類向來抵觸苦味物質[2]。盡管目前市場上如咖啡、酒類、茶等有苦味的食品很受歡迎，大多數情況下，消費者難以接受有苦味的食品，如苦味濃烈的奶酪、杏仁、果汁等。

食品中的苦味物質來源廣泛，且多為天然產物及其衍生物，如苦蕎中的槲皮素[3]，柑橘中的諾米林素、柚皮苷和檸檬苦素[4]，葫蘆科植物中的葫蘆素[5]，橄欖中的橄欖苦苷[6]等。此外，食品在加工、儲藏或微生物作用過程中也會產生苦味物質，表1中列舉了一些常見的苦味產生途徑。由于食品中的苦味來源復雜，含量極低，所以在實際生產加工及品質控制過程中苦味物質的檢測極具難度。

目前，食品苦味強度檢測大多通過對食品體系中苦味組分的定量檢測實現。如，苦味物質奎寧的定量檢測通過HPLC[12]、LC-MS/MS[13]、GS-MS[14]等方法實現。定量檢測苦味組分要求苦味組分為已知物質，對于未知苦味物質，需通過其他方法檢測苦味強度。此外，食品體系大多成分復雜，可能同時含有多種苦味物質，體系中不同組分的化學互作也可改變其感官特性。因此，苦味強度常通過感官分析等方法直接測定。本文根據苦味檢測方法的原理、適用范圍等將其大致分為：感官分析、生物評價、動物評價和儀器評價四大類。其中，生物評價包括細胞檢測器，納米檢測器和“氣管味蕾”檢測器等；動物實驗包括行為分析和電生理學實驗等。

1 感官分析

感官分析實驗具有結果表述詳細，能充分反映樣品特性等優點，是目前應用最廣泛的苦味物質分析方法。正確開展苦味物質的感官分析實驗必須具備合格的感官分析實驗室和評價員。

感官分析實驗室對檢驗區、樣品準備區、辦公室等的布局有嚴格要求，需按標準控制溫度、濕度、噪聲、氣味、裝飾、照明等因素[15]，一個合格的感官分析室通常造價不菲。

評價員需經過挑選和培訓后方能參與實驗。為讓評價員熟悉各類苦味物質，針對苦味的感官培訓常涉及多種苦味溶液，如硫酸鎂、水楊酸、咖啡因溶液等。硫酸鎂溶液代表苦味持續時間短的金屬類苦味物質；水楊酸溶液代表苦味持續時間長、主要在舌后部和喉部被感知的苦味物質；咖啡因溶液代表苦味持續時間長、可被整個口腔感知的苦味物質[16]。

國際上量化苦味強度的方法主要有閾值檢驗和標度法兩種。閾值檢驗通常以評價員感知到的樣品最低濃度為最低閾值，以不能讓感官評價員感知到的樣品最高濃度為最高閾值，實驗前均需通過預實驗確定待測溶液的濃度范圍，實驗結果也需重復測定1～2次，最后將所得最低閾值和最高閾值的均值作為每個評價員對該溶液的閾值檢驗值[17]。標度法一般以不同濃度的苦味溶液作對照，通過數字或表述程度的詞描述苦味強度[17]。如Liu等[8]以15分為標度，將質量比為0.03%、0.08%和0.15%的咖啡因水溶液的苦味強度分別定為2、5和10，以此為對照檢測樣品苦味強度。為確保實驗結果的有效性和可靠性，通常要求實驗遵循下述兩點要求：1) 標度應覆蓋所有味覺強度，并讓樣品分布相對離散，體現出樣本之間味覺強度的差異[17]。2) 確保評價員不對某個樣本產生心理預期，且評價員始終以相同的方法評價樣品[17]。標度法在實際操作中依然面臨諸多問題。例如，評價員會下意識避開標度最小或最大的刻度，使各樣品得分集中在中間刻度，導致實驗結果無法準確體現出樣品間的差異[17]。表2列出了一些利用感官分析量化苦味強度的案例。

表2 感官分析在苦味物質檢測中的應用

影響感官分析結果準確性的因素較多，包括基因型，生理因素，心理因素等。人對苦味物質的感受取決于基因，人的苦味受體基因基本相似，但存在差異，這些差異導致了人對某些苦味物質的感受不一致。典型的例子有丙基硫尿嘧啶(PROP)，由于基因型的差異，一部分人天生對PROP很敏感，他們難以接受咖啡因、柚皮苷等苦味物質。同時，他們對西柚汁、十字花科的蔬菜、茶等的接受度也低于常人，而對PROP不敏感的人則沒有這些體驗[24-26]。此外，感官分析的結果也受到生理因素和心理因素的雙重影響，生理因素主要包括適應現象、感官增強、感官抑制等，心理因素則包括期望錯誤、刺激錯誤等[17]。若評價員身體不適，也會對實驗結果造成不同程度的影響[17]。為提高感官結果的準確度，Susanne等[27]建立半舌測試法，即評價員僅使用半側舌頭來接觸被測溶液，而另外半側舌頭接觸空白對照。此法應用廣泛：如測定可可豆中有苦味的黃烷-3-醇及糖苷類物質的閾值[28]；測定3種花青素(原花青素、沒食子單寧、鞣花丹寧)的澀味閾值[29]等。

滋味稀釋分析(Taste dilution analysis，TDA)是一種利用感官分析確定食品中滋味物質閾值的方法[30]。為研究食品中苦味物質的具體成分，常將此法與分離、提純、鑒定等操作結合：先將食品中的各組分分離、提純，再利用此法評價各組分的苦味強度，篩選出有苦味的組分后再進行結構鑒定。但是，利用此法評價分離、提純的食品組分具有一定安全隱患，因為分離提純操作大多使用有害化學試劑，如Liu等[8]在小麥蛋白水解物苦味肽的分離純化中以甲醇作為制備液相的流動相，Güntherjordanland等[31]用正己烷、甲醇、甲酸等提取分離燕麥中的苦味生物堿和苦味皂苷。提取物濃縮后，試劑中的不揮發性雜質在濃縮物中富集，埋下安全隱患。因此，一般需對濃縮物進行核磁共振和色譜鑒定，確保樣品中不含有害物質后再進行感官分析[31]。

感官分析是苦味物質檢測最常用的方法，此法結果表述詳細，能充分反映樣品特性。樣品適用范圍廣，能檢測幾乎所有對健康無害的物質。但此法成本高，不適用于快速檢測或大規模檢測，且實驗開展時需要考慮安全性等問題。

2 生物評價

2.1 細胞檢測器

苦味受體(T2Rs)是一類在口腔中表達的負責苦味傳導的G蛋白偶聯受體(GPCRs)，有25種亞型[32]。當苦味物質進入口腔后，會與味蕾中相應的苦味受體結合，引起苦味受體構型改變從而激活胞內異源三聚體G蛋白，導致G蛋白中的Gα味蛋白與β3γ13二聚體相互分離；其中，Gα味蛋白激活磷酸二酯酶從而降低cAMP含量，β3γ13二聚體激活磷脂酶Cβ2(PLCβ2)；PLCβ2催化磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)分解為肌醇三磷酸(IP3)和二酰甘油(DAG)；產生的IP3激活IP3特異性受體(IP3R)，使內質網釋放鈣離子，鈣離子濃度升高打開了瞬時受體電位離子通道蛋白5(TRPM5)，使細胞發生去極化，釋放神經遞質，從而將刺激傳遞給大腦[33]。見圖1。

圖1 人體苦味傳導機制圖

基于人體苦味傳導機制，將苦味受體TAS2Rs和Gα質粒DNA共轉染HEK293細胞即得到了可識別特定苦味物質的細胞，利用熒光染料對細胞內鈣離子染色后，一旦此細胞接觸特定苦味物質，細胞內鈣離子濃度即發生變化，引起細胞熒光強度變化，分析熒光強度可得到苦味物質的濃度。一種苦味受體能特異性識別一部分苦味物質，若要鑒定所有苦味物質，需將25種苦味受體基因全部轉入細胞中。但是，隨轉染物質增多，轉染效率下降，故目前多數案例僅將一個苦味受體轉入細胞內。表3列出了細胞檢測器的一些構建實例。

表3 細胞檢測器在苦味物質檢測中的應用

細胞檢測器在體外模擬了人的苦味傳導通路，準確度和靈敏度與感官評價法接近。與感官評價法相比，此法的優點是：1) 由于細胞檢測是體外實驗，故可檢測毒性未知且不適合感官評價的物質；2) 細胞檢測器可實現高通量檢測，提高了檢測效率；3) 此法是微量檢測法，節省樣品，適用于檢測食品中分離提純得到的單一組分。此法的缺點是：1) 細胞檢測器的制作過程復雜，技術要求高，成本高；2) 若要全面檢測苦味物質，需構建全套25個轉基因細胞；3) 需考慮待檢測物質對細胞的毒性。目前，該技術多應用于醫藥等高附加值研究領域，在食品領域的應用尚少。相信隨著一些技術的不斷成熟與發展，這一高靈敏度的苦味檢測手段會逐漸在食品領域普及。

2.2 納米檢測器

苦味物質進入人口腔中后，選擇性結合苦味受體，而細胞檢測器并沒有考慮這一過程。為了充分模擬苦味物質進入人體口腔后發生的一系列變化，Kim等[38]以單壁碳納米管為材料制成了一種可檢測苦味物質強度的場效應晶體管檢測器。單壁碳納米管是一種由單層石墨片沿六邊形軸向的不同取向卷曲形成的無縫、中空的一維碳納米材料，按導電性不同可以分為金屬性和半導體性單壁碳納米管，其中，半導體性的單壁碳納米管可用作場效應晶體管的傳導通道[39]。場效應晶體管是一種具有電子開關功能的電子元件，廣泛應用于傳感器、信號發射器等裝置[40]。Kim等[38]將人苦味受體蛋白TAS2R38和脂質膜固定在單壁碳納米管場效應晶體管上，制成了可選擇性檢測苦味物質的檢測器。當此裝置接觸到特定苦味物質時，TAS2R38與苦味物質結合，引起TAS2R38結構改變，導致單壁碳納米管場效應晶體管與金屬電極間的接觸電阻發生變化，引起電信號改變，經過信號轉換可得到該物質的苦味強度。

除單壁碳納米管場效應晶體管外，其他納米材料也被應用于苦味檢測器的制備。與上述方法類似，Song等[41]將TAS2R38以共價結合的方式固定在羧基化聚吡咯納米管場效應晶體管上，制成一種苦味檢測器，利用此檢測器檢測多種呈味物質(阿斯巴甜、蔗糖、谷氨酸、糖精、PTC、PROP、尿嘧啶、苯脲等)后發現，此檢測器的選擇性與人類相似，且靈敏度高。此外，Wu等[42]將苦味受體蛋白TAS2R4固定在經過修飾的石英晶體微天平上，并發現苦味物質苯甲地那銨在檢測器上的響應值表現出劑量依賴性。

納米檢測器與細胞檢測器的原理相同，故適用范圍一致。兩種方法的主要區別在于：納米檢測器模擬了口腔對苦味物質的選擇性，但細胞檢測器未考慮此過程。

2.3 “氣管味蕾”檢測器

苦味受體除了存在于口腔中，還存在于其他組織中。Deshpande等[43]發現特定的苦味物質可誘發氣道平滑肌細胞內鈣離子濃度增加，進而引起氣道平滑肌細胞的舒張和氣道擴張。通常細胞內鈣離子濃度增加會導致細胞收縮，故認為是大電導鈣激活型鉀通道開放引起了上述現象。Zhang等[44]發現Deshpande等[43]在實驗中使用的苦味物質氯喹可以阻斷大電導鈣激活型鉀通道，此通道開放引起氣道平滑肌細胞舒張和氣道擴張的猜想被推翻。目前針對該現象普遍認可的觀點是：苦味受體在氣道平滑肌中能激活兩個相反的鈣離子通路[33]。

人體氣道平滑肌細胞中，除苦味受體基因外，與味覺有關的其他基因皆不表達[43]。氣道平滑肌中表達量最高的是第10、14、31號苦味受體；而第4、5、19號苦味受體也會選擇性表達[45]。基于此，朱友偉[46]通過提取豬氣道平滑肌苦味受體構建了“氣管味蕾”苦味檢測器，此檢測器可根據苦味受體與苦味物質的結合量推測物質苦味強度。此外，該檢測器還檢測了掩味劑磷脂酸、苯甲地那銨等對苦味受體與鹽酸奎寧結合的影響，發現部分掩味劑效果不顯著。

苦味受體除在氣管平滑肌中表達外，還在人和動物的其他器官組織中有表達。表4中列舉了一些檢測到苦味受體表達的組織或器官。目前，將非口腔組織中的苦味受體應用于苦味檢測的案例較少：僅Hu等[51]用小鼠睪丸細胞構建了苦味檢測器，該檢測器對不同濃度的苦味溶液響應信號呈劑量依賴性，且該檢測器對酸、甜、咸、鮮味的溶液無響應。此類檢測器與細胞檢測器相比，省去了將苦味受體基因轉入細胞的過程，降低了實驗的操作難度，且適用于幾乎所有物質的檢測，故有良好的市場前景。

表4 苦味受體表達部位

3 動物評價

苦味檢測的相關動物評價方法可分為不涉及手術的行為分析和涉及手術的電生理學實驗[52]等，其中，行為分析可分為雙瓶偏好實驗[53]和簡短攝取實驗[54]。

雙瓶偏好實驗即一種通過測定動物對苦味溶液的舔舐次數[55]或攝取量與總量的比值[56]對苦味程度進行定量分析的方法。此方法雖然被普遍采用，但具有低通量和針對性不強的缺點。每次實驗需要大量的準備時間，且此類實驗的干擾因素頗多，無法針對性說明被測溶液的某一特定感官特性[57]。

苦味物質的簡短攝取實驗即一種通過反復對小鼠進行苦味刺激(5～30 s)，用特制的味覺計記錄小鼠的反應，通過數據分析得到該刺激味覺特性的方法[58]。與雙瓶偏好實驗相比，該法可檢測到溶液體積的微小變化，每只小鼠在每一次實驗中的表現都能被詳細記錄，且實驗結果的反應指標有多個，這些都有助于減少實驗中異常數據的產生[57]。Jr等[59]用雙瓶偏好實驗及簡短攝取實驗同時研究小鼠舔舐次數與蔗糖濃度的關系發現，理論上小鼠對蔗糖的舔舐次數應隨著蔗糖溶液濃度的增大而增加，但是在24 h雙瓶偏好實驗中，量效關系曲線卻呈現出倒U型，即小鼠的舔舐次數在中間濃度時達到峰值，而簡短攝取實驗結果則與理論值相符，因此認為簡短攝取實驗比雙瓶偏好實驗更準確。

電生理學實驗即一種通過手術置入檢測器，測定動物接觸苦味物質后的神經沖動，將神經沖動信號進行相關轉化，進而獲得苦味物質的味覺特性[60]的方法。Qin等[61]將自制16通道微電極陣列植入小鼠的大腦皮層，獲得一種高靈敏度苦味傳感器。當小鼠攝入苦味物質后，其大腦神經網絡的電生理活動可被電位監測器監測，具有不同感官特性的溶液引起的小鼠大腦的不同活動，通過分析信號，可得到各溶液感官特性。

鼠基因與人基因相似[62]，味覺系統差異不大，故鼠是苦味檢測相關實驗中常用的動物。另外，也有少數案例利用豬等哺乳動物進行苦味檢測[63]。總體而言，利用動物替代人類進行苦味檢測可在感官分析的基礎上進一步擴大檢測范圍，一些毒性未知的物質亦可進行苦味檢測。實驗類型不同則結果準確性不同：動物的行為分析法會受到動物自身條件的影響導致準確度低，電生理學實驗可克服這一缺點，但由于要對實驗動物進行手術，故實驗難度大，應用少。

4 儀器評價

電子舌是一種由傳感器組成、利用數學方法處理信號、能識別多種味道的系統[64]，廣泛應用于食品加工過程監測、食品新鮮度評估、食品貨架期探究、食品成分鑒定和食品質量控制等研究。

電子舌的傳感器陣列在接觸液體樣品后會產生信號變化，轉變為數據后，利用多元數據分析處理，即得到該樣品的感官特性。傳感器陣列可分為電位傳感器、伏安傳感器、光學傳感器和質量變化傳感器等[58]。傳感器的膜決定了實驗結果的重現性和穩定性，膜一般由無機(多晶或硫屬玻璃)或有機(類脂膜)材料制成[65]。后者易被有機溶液溶解，故不適用于高酒精度酒類中苦味物質的檢測。此外，不溶于水的苦味物質無法解離出離子，故不能引起探頭電勢變化，其苦味值無法被檢測。因而，若要檢測食用油等樣品中的苦味，應將樣品在水中分散，震蕩使水溶性苦味物質溶出后再測定。電子舌的數據處理方法主要包括主成分分析(PCA)、偏最小二乘法(PLS)和人工神經網絡(ANN)等。

多數電子舌僅能對各物質進行感官特性區分，故電子舌在摻假檢驗[66]、成分檢驗[67]、食品產地區分[68]等領域應用廣泛。也有部分電子舌能對每一種味覺特性進行定量描述，如tala等[18]以咖啡因、奎寧水溶液為標準對鮮食橄欖油中的苦味程度進行了打分，發現電子舌的響應值與濃度的對數呈線性相關，相關系數分別達到0.830～0.831(咖啡因)和0.830～0.980(奎寧)。Ito等[69]將11名感官評價員對不同濃度鹽酸奎寧的評價結果與電子舌的檢驗結果進行相關性分析，發現相關系數高達0.962 1。表5列出了近年來利用電子舌進行苦味檢測的一些案例，涉及苦味強度檢測、苦味掩蔽、產品品種區分等。

表5 電子舌在苦味物質檢測中的應用

電子舌最大的局限性在于：只能給出儀器對于待測物質的響應值，但無法描述被檢測物質本身的特性[64]。自電子舌概念提出后以來，電子舌逐漸向微型化、集成化方向發展，并實現了高通量檢測，其檢測結果的準確度和精密度均有顯著提高，尤其是區分不同樣品間的差異。但電子舌處理滋味豐富的樣品時依然存在局限性，滋味間的互作及檢測結果的準確性依舊是困擾電子舌的難題。

5 展望

感官分析是目前苦味檢測中使用最普遍的方法，能充分反映樣品特性，但感官分析不適用于高通量檢測且不能檢測安全性未知的樣品。生物評價，如細胞檢測器、納米檢測器、“氣管味蕾”檢測器等由于技術、成本制約，目前應用較少，若能突破檢測器制造的技術壁壘并進一步降低成本，這些微量檢測技術將在苦味物質的微量檢測市場占據主導地位。在動物評價方法中，動物行為分析誤差較大，動物電生理學實驗操作難度大，這些缺點限制了動物評價的發展。儀器評價雖存在檢測結果不全面、對某些物質的感官特性評價不準確等問題，但能實現高通量檢測，且操作便捷，若能研制出更接近人體味蕾的探頭材料，并開發出能充分模擬人的味覺傳導過程的程序，儀器評價將成為常量苦味檢測的主流方法。