基于液相色譜串聯質譜技術對血清同型半胱氨酸常規檢測系統的正確度評價

鐘巧玲， 孫 驥， 翁旭琦， 馮 萍， 謝丹蕓

（1. 重慶市巴南區第二人民醫院檢驗科，重慶 400054；2.寧波出入境檢驗檢疫局技術中心，浙江 寧波 315000；3. 美康生物參考實驗室，浙江 寧波 315104）

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是一種含硫氨基酸，存在于血液及組織中，是人體內蛋氨酸循環的中間代謝產物，參與體內能量代謝[1]。正常情況下，人體中的Hcy水平為5～15 μmol/L，是正常的代謝中間產物[2]。近年來，有臨床研究證實，Hcy水平與血脂水平變化、各種心腦血管疾病及其并發癥的發生和發展以及轉歸有重要關系[3-4]。高水平Hcy與老年癡呆、腫瘤的發生和發展有密切關系，其可作為血清腫瘤標志物用于腫瘤診斷或療效判斷[5-7]。因此，及時、準確、高效地檢測血液中Hcy水平具有重要意義。

目前，用于Hcy檢測的方法較多，有酶循環法、氣相色譜-質譜聯用法（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）、酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、放射免疫分析法、高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）、全自動熒光偏振免疫法及液相色譜串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC/MS/MS）等，這些方法各自存在不同的優勢和不足[8-12]。其中，GC-MS和同位素稀釋液相色譜串聯質譜法（isotopedilution liquid chromatography-tandem mass spectrometry，ID-LC/MS/MS）被檢驗醫學溯源性聯合委員會（the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM）認定為參考方法[13]，這2種方法特異性強、敏感性高、重復性好，但設備昂貴且操作復雜、耗時較長。HPLC應用廣泛，費用較低。放射免疫分析法靈敏度高、特異性強，但操作繁瑣，且同位素的放射污染對人體有害。酶循環法檢測快速，適用于全自動生化分析儀，無需樣本預處理。因此，本研究以ID-LC/MS/MS為比對方法，評價酶循環法測定血清Hcy水平的正確度，為臨床常規檢測血清Hcy的正確性提供依據；并通過與參考方法比對，調整常規檢測系統，保證常規檢測系統的測定結果與參考方法一致，以提高常規臨床檢測的質量。

1 材料和方法

1.1 樣本

美國國家標準和技術研究院（the National Institute of Standards and Technology，NIST）SRM 1950標準物質，20份新鮮單人份血清樣本，5個水平的Hcy工作校準品。

1.2 儀器與試劑

AB SCIEX QTRAP 5500液相色譜串聯質譜系統購自美國AB SCIEX公司，XS 205DU型電子分析天平購自瑞士METTLER TOLEDO公司，Eppendorf 移液器、5427R 高速冷凍離心機、Heidolph Multi Reax旋渦混合器均購自德國Eppendorf AG公司，Millipore超純水儀購自美國Millipore公司。Hcy-d4內標購自美國Iso Sciences公司，DL-二硫蘇糖醇和三氟乙酸購自美國Sigma公司，甲醇（色譜級）、甲酸（色譜級）、乙腈（色譜級）購自美國Thermo Fisher公司。7180全自動生化分析儀（日本日立公司）及配套試劑（酶循環法）、校準品。實驗用水為一級水。

1.3 ID-LC/MS/MS

1.3.1 樣本前處理 用重量法稱取樣本或標準物質于離心管中，分別加入內標、乙腈溶液，旋渦混合離心后取上清液100 μL，用甲醇水溶液稀釋至1 mL，混勻后檢測。

1.3.2 測定條件 （1）液相色譜條件：流動相A為0.1%甲酸甲醇溶液，流動相B為0.1%甲酸水溶液，流速為0.5 mL/min，進樣量為3 μL，柱溫為30 ℃，梯度洗脫；（2）質譜分析條件：電噴霧電離源，離子化電壓為5 500 V，氣簾氣為35 psi，碰撞氣強度為中等，霧化溫度為550 ℃，霧化氣為55 psi，輔助加熱氣為40 psi，多反應監測模式掃描分析，峰面積定量。

1.3.3 樣本檢測 采用ID-LC/MS/MS檢測NIST SRM 1950標準物質、5個水平的Hcy工作校準品和20份新鮮單人份血清。

1.4 酶循環法

采用7180全自動生化分析儀及配套試劑測定5個水平的Hcy工作校準品和20份新鮮單人份血清。

1.5 統計學方法

采用Excel 2013軟件和Origin 8.1軟件進行統計分析。以ID-LC/MS/MS作為比對方法，評價Hcy常規檢測系統測量結果的正確度。采用改良Bland-Altman圖形分析法評價常規方法（酶循環法）與比對方法之間的偏移。

2 結果

2.1 ID-LC/MS/MS的正確度驗證

NIST SRM 1950標準物質證書給出的Hcy水平為（8.50 ± 0.20）μmol/L。采用ID-LC/MS/MS檢測NLST SRM 1950標準物質，測定結果與證書一致，相對偏移＜1.0%。見表1。

表1 ID-LC/MS/MS檢測NIST SRM 1950標準物質的結果

2.2 酶循環法與ID-LC/MS/MS的比對

采用ID-LC/MS/MS和酶循環法同時檢測20份新鮮單人份血清。以ID-LC/MS/MS測定結果為X軸，酶循環法測定結果為Y軸，進行方法學比對。2種方法的線性擬合方程為Y=1.204 1X+0.364 6（r2=0.987 9）。見圖1。

采用改良Bland-Altman圖形分析法進行分析，2種方法的測定結果不一致，酶循環法測定結果整體偏高，平均偏移為24.0%。見圖2。

圖1 酶循環法與ID-LC/MS/MS測定結果的比較

圖2 酶循環法與ID-LC/MS/MS的Bland-Altman偏移圖

2.3 酶循環法常規檢測系統的調整

采用ID-LC/MS/MS和酶循環法同時檢測5個水平的Hcy工作校準品，并根據測定結果調整酶循環法試劑盒的校準品值。調整結果后的測定結果見表2。以ID-LC/MS/MS測定結果為X軸，以酶循環法測定結果為Y軸，進行方法學比對。調整后的酶循環法與ID-LC/MS/MS的線性擬合方程為Y=0.988 6X+0.260 3（r2=0.999 7）。見圖3。

采用改良Bland-Altman圖形分析法進行分析，經校準品值調整后，酶循環法的測定結果與ID-LC/MS/MS一致，平均偏移為-0.09%。見圖4。

表2 酶循環法調整后與ID-LC/MS/MS測定結果的比較

圖3 酶循環法調整后與ID-LC/MS/MS法結果比較

圖4 調整后的酶循環法與ID-LC/MS/MS的Bland-Altman偏移圖

3 討論

Hcy水平的變化是多種疾病診斷的依據。目前，血清Hcy水平多采用全自動生化分析儀進行檢測。因此，為確保臨床檢測結果的準確性，有必要對Hcy的常規檢測系統進行正確度評價。

Hcy的檢測方法有很多。本研究對臨床上使用比較廣泛的酶循環法進行了評價。首先對JCTLM推薦的參考方法——ID-LC/MS/MS進行了正確度評價，結果顯示ID-LC/MS/MS測定NIST SRM 1950標準物質的結果與標準證書標示值的偏移＜1.0%，準確性良好。因此，ID-LC/MS/MS可作為Hcy常規檢測系統正確度評價的比對方法。

采用酶循環法和ID-LC/MS/MS同時檢測20份血清樣本的Hcy水平。常規方法的正確度依據線性擬合方程斜率k=1.00±0.02且截距接近于0、設定偏移值并用改良Bland-Altman圖形分析法進行判斷。酶循環法和ID-LC/MS/MS測定結果的線性擬合方程為Y=1.204 1X+0.364 6（r2=0.987 9），平均偏移達24.0%。由此說明常規方法和參考方法測定結果的相關性并不理想，2種方法存在較大的偏移，為保證臨床檢測結果的準確性，需對其檢測系統進行校正。

采用ID-LC/MS/MS和酶循環法同時測定5個水平的工作校準品，根據測定結果反復調整校準品值，直至酶循環法的測定結果與ID-LC/MS/MS一致。調整后的酶循環法與ID-LC/MS/MS的線性擬合方程為Y=0.988 6X+0.260 3（r2=0.999 7），平均偏移為-0.09%。由此可見，酶循環法調整后的測定結果與ID-LC/MS/MS的測定結果達到了一致。

綜上所述，采用酶循環法測定血清Hcy水平的正確度難以保證。因此，需要利用參考方法對常規檢測系統進行正確度評價，同時也可以利用參考方法校準常規檢測系統，以有效保證臨床樣本測定結果的正確性，提升臨床檢測質量。為保證臨床樣本的準確測定，各廠家和臨床實驗室應建立常規檢測項目的測量正確度評價方法，以保證常規檢測系統的正確性[14]。