FTIR技術對玉米及副產品脂質分子結構與營養價值相關關系的研究

孫凱晶，李 昕，劉 帥，王馨影，張廣寧，楊金山，辛杭書，張永根

(東北農業大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030)

中國是玉米生產和消費大國，同時玉米還是中國主要的飼料原料之一。根據《2016/2017年度國內玉米市場展望》[1]分析，2016年玉米產量為21 245萬噸，需求增幅達7.9%，部分玉米則用于工業深加工。玉米皮、玉米蛋白粉、玉米胚芽餅以及玉米DDGS(谷物干酒糟及可溶物)等均為玉米深加工副產品。其中，絕大部分的玉米副產品作為飼料資源飼喂給畜禽，因此對飼料品質要求尤為重要。而如何保持共同產品加工水平一致性是對市場飼料產品質量的一個主要關注點，唐博等[2]也論述了市場上相同的商品名稱，其營養成分的差異卻很大。飼料中粗脂肪含量與加工工藝流程相關[3-4]，其脂質水解酸敗還受到溫度和水分含量的影響[5]，也就是說批次對飼料的營養價值影響較大。根據Gamage等[6]研究報道，同樣得出批次對飼料樣品的營養特性存在一定的影響。

此外，以往大多數試驗研究是采用常規方法研究玉米及其副產品的營養價值，其工作量大、用時較長。而傅立葉變換紅外光譜技術(FTIR)是一種快速、直接，不破壞生物樣本組織內部結構的先進生物分析技術，并且可以提供組織中的化學成分和官能團的數量、組成、結構及分布有關的信息[7-8]。Yu等[8]研究FTIR分析技術證明，植物相似的形態學部分有相似的光譜特征和化學組成，不同的形態學部位呈現出不同的光譜特征。現已有研究表明，可以利用FTIR分子技術來評價飼料質量、檢測其化學結構構象，以及有關光譜結構與營養可用性之間關系的研究[9-11]。然而，很少有利用FTIR技術分析脂質營養特性的研究，進而有關玉米及其副產品的脂質研究還未見報道，對于來自同一玉米飼料加工廠的不同批次問題就更少被研究并進行評價。通過研究發現，脂質的品質、營養價值以及動物對其利用情況可能不僅與脂肪含量有關，也與脂質內部的分子結構特征存在一定的相關性。這些脂質內部的分子結構特征包括CH3反對稱伸縮、CH2反對稱伸縮、CH3對稱伸縮、CH2對稱伸縮、C=O伸縮和脂質不飽和結構組[12]。

本試驗旨在探求不同批次玉米及其副產品營養特性和脂質分子結構的差異及其兩者之間是否存在相關關系，進而在分子結構層面對玉米及其副產品的脂質效價進行更深層次地了解，為利用FTIR技術快速、準確測定飼料營養價值提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品采集與測定

本次試驗采用四分法采集樣本。于2016年6-7 月在吉林省松原嘉吉生化有限公司采集3批飼料樣品(n=1、2、3；i=玉米、玉米皮(噴漿)、玉米胚芽(帶殼)、玉米胚芽餅、玉米蛋白粉)，共15個樣本。一部分樣品用粉碎機過1 mm孔篩粉碎并充分混勻，用于常規化學成分分析；另一部分樣品粉碎過0.25 mm孔篩，并于東北農業大學化學館進行光譜分析測定(型號：島津FTIR-8400S)。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 常規化學成分分析 測定指標：干物質(DM)、有機物質(OM)、粗蛋白(CP)、中性洗滌纖維 (NDF)和粗脂肪(EE)。其中，DM、OM、CP和EE的分析根據AOAC(1990)[13]的程序進行測定，NDF根據Van Soest等[14]的標準過濾方法并結合ANKOM濾袋技術進行測定。

1.2.2 光譜數據的采集及分析 光譜分析試驗在東北農業大學化學館實驗室進行，利用傅里葉變換紅外光譜儀進行光譜測定，收集不同批次的玉米及其副產品的脂質分子光譜。將2 mg干燥的樣品與溴化鉀在1∶100的比例下，混合于瑪瑙研缽中，在紅外烤燈照射下，研磨成粉末并充分混和均勻后，用紅外專用壓片機(型號：769YP-15A粉末壓片機)壓成適當薄片。在飼料樣品光譜收集之前，對空氣(主要是二氧化碳)進行校正。然后通過光譜管理軟件對樣品薄片進行光譜掃描并收集中紅外波段光譜數據，掃描波段在4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數為128，每個樣品做10個重復。

利用OMNIC 8.2軟件對掃描樣品后獲得的紅外光譜進行處理分析，分析相關功能團的數據。通過OMNIC 8.2軟件中的傅里葉自去卷積(FSD)[15]和二階導函數功能(2ndderivative)[16]確定CH3反對稱伸縮、CH2反對稱伸縮、CH3對稱伸縮、CH2對稱伸縮的光譜區域及峰高位置。一般測定并記錄在脂質光譜特征峰波段內(包括CH拉伸區域(ca. 2 984～2 781 cm-1)、不飽和脂質拉伸區域(ca. 3 016～2 971 cm-1)和脂質酯的羰基拉伸區域(ca. 1 826～1 693 cm-1))典型分子結構的峰高、峰面積、峰高比和峰面積比。

1.3 統計分析

通過Excel 2007軟件進行初步統計處理，采用SAS 9.4軟件中的PROC MIXED程序對常規化學成分指標以及光譜分子結構峰值進行數據分析。具體模型為Yijk=u+Fi+Bj+Fi*Bj+eijk，其中，Yijk是對自變量ijk的因變量；u是變量的平均值；Fi是不同樣品即玉米及其副產品(i =5；玉米、玉米皮、玉米胚芽(帶殼)、玉米胚芽餅和玉米蛋白粉)；Bj是不同處理即3個批次(j =1、2、3)；Fi*Bj是因子F在水平i和因子B在水平j相互作用的固定效應；eijk是與觀察ijk相關的隨機誤差。Tuley-Karmaer檢驗用于比較不同樣品和批次間的差異，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。對于光譜脂質分子結構參數與常規營養成分各指標之間的相關性采用SAS 9.4軟件中的PROC CORR模塊進行分析。本試驗還采用Statistica 8.0軟件(StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA)對脂質分子結構圖譜進行多變量分析，其中包括多層聚類分析(CLA)和主成分分析(PCA)兩種分析方法。

2 結 果

2.1 不同批次玉米與其副產品的常規化學成分分析

由表1可見，不同批次玉米與其副產品的有機物(OM)、粗蛋白(CP)、中性洗滌纖維(NDF)、粗脂肪(EE)含量之間均差異顯著(P<0.05)，并且兩個因素之間的互作效應顯著(P<0.05)。玉米皮的中性洗滌纖維(NDF)含量(57.04%DM、46.89%DM和50.50%DM)明顯高于其他飼料樣品，其中第一批次含量最高(P<0.05)，第三批次的OM含量最低(P<0.05)。玉米蛋白粉的OM和CP含量最高(分別是98.67% DM～99.06% DM和64.18% DM～69.94% DM)，而NDF含量最低，其中第二批次的OM和第三批次的CP含量最高，以及第一批次的NDF含量最低。而玉米胚芽(帶殼)的脂肪(EE)含量最高(34.57% DM～37.24% DM)，其中第一批含量最高。對于脂肪(EE)含量，其中玉米胚芽餅的含量次之(12.24% DM～13.45% DM)，玉米蛋白粉的含量最低(0.29% DM～0.65% DM)。

2.2 不同批次玉米與其副產品的脂質結構光譜參數值分析

由表2可見，玉米與其副產品之間的脂質分子結構光譜區域的特征峰參數(CH3反對稱伸縮峰高、CH2反對稱伸縮峰高、CH3對稱伸縮峰高、CH2對稱伸縮峰高、CH伸縮峰總面積、不飽和脂質(ULB)伸縮峰高和峰面積、脂質酯的羰基(LECC)伸縮峰高和峰面積以及它們之間的比值)之間存在顯著差異(P<0.05)。對飼料樣品不同批次分析，僅LECC峰高值和CH2反對稱伸縮/CH2對稱伸縮峰高比值之間不存在顯著差異(P>0.05)。在CH3反對稱伸縮峰高、CH2反對稱伸縮峰高、CH3對稱伸縮峰高、CH2對稱伸縮峰高、CH伸縮峰總面積特征參數中，兩因素(批次和樣品)之間不存在顯著性的互作效應(P>0.05)。從CH3和CH2反對稱與對稱伸縮、不飽和脂質伸縮和脂質酯的羰基伸縮概況來看，玉米胚芽(帶殼)的特征值均顯著高于玉米和其他副產品的參數含量(P<0.05)，而玉米蛋白粉的ULB特征的峰高和峰面積值均顯著低于玉米和其他副產品的數值(P<0.05)。在脂質光譜特征比值方面，玉米胚芽(帶殼)的CH3反對稱伸縮/CH3對稱伸縮峰高比值、不飽和脂質伸縮/CH伸縮的峰面積比值、脂質酯的羰基伸縮/CH伸縮的峰面積比值和不飽和脂質伸縮/脂質酯的羰基峰面積比值最高(P<0.05)，然而CH3對稱/CH2對稱伸縮峰高比值在玉米胚芽的第一批次中最低(P<0.05)。CH3反對稱/CH2反對稱伸縮峰高比值、CH3反對稱/CH3對稱伸縮峰高比值以及反對稱伸縮/對稱伸縮峰面積比值均是玉米籽粒顯著低于其他飼料樣品(P<0.05)。玉米蛋白粉光譜分子結構中CH3反對稱/CH2反對稱伸縮峰高比值和反對稱伸縮/對稱伸縮峰面積比值都顯著高于其他飼料樣品(P<0.05)，而在不飽和脂質伸縮/CH伸縮峰面積比值、不飽和脂質/脂質酯的羰基峰高比值、不飽和脂質/脂質酯的羰基峰面積比值都顯著較低(P<0.05)。

2.3 不同批次玉米與其副產品的脂質營養價值與脂質分子結構之間的相關關系分析

由表3可得，脂質的化學成分(EE)與其光譜參數(除了不飽和脂質/脂質酯的羰基伸縮峰高比值)之間均存在顯著性相關(P<0.05)。在脂質的光譜參數中，EE與CH3反對稱/CH2反對稱伸縮峰高比值、CH3對稱/CH2對稱伸縮峰高比值、CH2反對稱/CH2對稱伸縮峰高比值之間存在顯著負相關(r=-0.40～-0.86，P<0.05)，而與其他光譜參數(除不飽和脂質/脂質酯的羰基伸縮峰高比值)間存在顯著正相關(r=0.32～0.98，P<0.05)。NDF與反對稱伸縮/對稱伸縮峰面積比值呈顯著性負相關(r=-0.45，P<0.05)，與其他脂質參數無相關性(P>0.05)。反對稱伸縮/對稱伸縮峰面積比值與OM和CP之間有顯著性正相關(分別為r=0.48和r=0.68，P<0.05)。CP與CH3反對稱/CH2反對稱伸縮峰高比值存在高度正相關(r=0.98，P<0.05)， 而與不飽和脂質伸縮/CH伸縮的峰面積比值、脂質酯的羰基伸縮/CH伸縮的峰面積比值、不飽和脂質/脂質酯的羰基峰高比值、不飽和脂質/脂質酯的羰基伸縮峰面積比值呈顯著負相關(r=-0.40～-0.62，P<0.05)。

2.4 不同批次玉米與其副產品的脂質光譜結構多變量分析

玉米與其副產品的脂質化合物分子結構(ca.3 016～2 781 cm-1與1 826～1 693 cm-1)的層序聚類分析(CLA)和主成分分析(PCA)結果見圖1～圖3。不同批次間的樣本均相互重疊，無法分開。從CH3和CH2反對稱與對稱伸縮區域(ca. 2 984 ～2 781 cm-1)概況可知，玉米胚芽(帶殼)與其他飼料樣品間的樹狀圖在距離20以內可以完全分開(圖1a)。飼料樣品(除玉米胚芽外)的主成分(PCA)存在部分互相重疊，但在PCA分析中，玉米胚芽可以完全區分開來(圖1b)，這與CLA結果相似。其中PCA分析中的第一和第二主成分分別占總變異數的72.91%和23.13%(圖1b)。在不飽和脂質伸縮相關光譜區域內(ca. 3 016～2 971 cm-1)， 玉米胚芽(帶殼)也可以與其他飼料樣品區分開(圖2a)，其中的第一和第二主成分分別占總變異數的87.01%和12.80%(圖2b)，此外玉米胚芽餅也能完全獨立分開(圖2b)。在脂質酯的羰基(C=O)伸縮光譜(ca. 1 826～1 693 cm-1)多變量分析中(圖3)，玉米胚 芽(帶殼)與其他飼料樣品可以完全分開(圖3a)，

表3 不同批次玉米及其副產品的脂類光譜結構特征與基本化學成分之間的相關性

P<0.01表示極顯著相關，P<0.05表示顯著相關

P<0.01 means highly significant correlation,P<0.05 means significant correlation

a.不同批次的玉米與其副產品CH3和CH2不對稱和對稱伸縮區域(ca . 2 984～2 781 cm-1，方法為歐氏距離，聚類方法為Ward算法，下同)；b. PCA光譜分析不同批次玉米與其副產品中得到其第一主成分和第二主成分的散點圖：第一和第二主成分的總方差分別是72.91%和23.13%。A.玉米籽粒；B.噴漿玉米皮；C.玉米胚芽；D.玉米胚芽餅；E.玉米蛋白粉；1.第一批次；2.第二批次；3.第三批次。下同a. CLA spectral analysis of the CH3 and CH2 asymmetric and symmetric stretching regions (ca. 2 984-2 781 cm-1) obtained from different batches of samples(Distance method is euclidean, Cluster method is Ward’s algorithm, the same as below); b. Scatter plot of the 1st principal component vs. the 2nd principal component of PCA analysis of spectrum obtained from different batches of samples: the 1st and 2nd principal components explain 72.91% and 23.13% of the total variance, respectively. A. Corn kernel; B. Corn gluten feed; C. Corn germ with pericarp; D. Corn germ cake; E. Corn gluten meal; 1. The first batch; 2. The second batch; 3. The third batch. The same as below圖1 多變量分析不同批次玉米及其副產品在CH3和CH2不對稱和對稱拉伸光譜區域內的脂質分子特征Fig.1 Multivariate molecular spectral analyses of the CH3 and CH2 asymmetric and symmetric stretching on a molecular basis in different batches of corn and its by-products

a.不同批次的玉米與其副產品不飽和脂質伸縮區域(ca . 3 016～2 971 cm-1)；b. PCA光譜分析不同批次玉米與其副產品中得到其第一主成分和第二主成分的散點圖:第一和第二主成分的總方差分別是87.01%和12.80%a.CLA spectral analysis of the ULB stretching regions (ca. 3 016-2 971 cm-1) obtained from different batches of samples; b. Scatter plot of the 1st principal component vs. the 2nd principal component of PCA analysis of spectrum obtained from different batches of samples: the 1st and 2nd principal components explain 87.01% and 12.80% of the total variance, respectively圖2 多變量分析不同批次玉米及其副產品不飽和脂質伸縮光譜區域內的脂質分子特征Fig.2 Multivariate molecular spectral analyses of the unsaturated lipid bands on a molecular basis in different batches of corn and its by-products

a.不同批次的玉米與其副產品脂質酯的羰基伸縮區域(ca. 1 826～1 693 cm-1)；b. PCA光譜分析不同批次玉米與其副產品中得到其第一主成分和第二主成分的散點圖:第一和第二主成分的總方差分別是68.16%和29.73%a.CLA spectral analysis of the lipid ester C=O carbonyl regions (ca. 1 826-1 693 cm-1) obtained from different batches of samples; b. Scatter plot of the 1st principal component vs. the 2nd principal component of PCA analysis of spectrum obtained from different batches of samples: the 1st and 2nd principal components explain 68.16% and 29.73% of the total variance, respectively圖3 多變量分析不同批次玉米及其副產品脂質酯的羰基伸縮光譜區域內的脂質分子特征Fig.3 Multivariate molecular spectral analyses of the lipid ester C=O carbonyl on a molecular basis in different batches of corn and its by-products

PCA分析中的第一和第二主成分分別占總變異數的68.16%和29.73%(圖3b)，與CLA結果相似。并且玉米及其副產品在PCA分析中均能完全區分開(圖3b)。這一結果說明玉米胚芽(帶殼)與其他樣品間的分子結構存在差異，但是其他飼料樣品之間在內部分子結構方面也存在一定的相似性，這也進一步支持了表2中光譜數據的分析結果。

3 討 論

3.1 不同批次玉米與其副產品的常規化學分析

對于玉米及其副產品營養價值的研究已經取得了一定的成果。例如：在玉米蛋白粉的營養成分及應用的研究中，張鋒斌和李維平[17]得出了玉米蛋白粉與玉米籽粒的粗蛋白(65%和8.9%)和脂肪(7%和3.9%)含量，其中玉米蛋白粉的脂肪含量結果與本次試驗結果存在差異。但吳春勝等[18]在2004年的研究中也對玉米營養成分進行了分析，得出普通玉米的脂肪含量為4.62%，較高于本次的研究值(3.74% DM～3.85% DM)。在王燕等[19]的研究中得出，玉米皮的中性洗滌纖維含量為50.85%～58.00%，較高于本次試驗的第二批玉米皮的含量。在本研究中，第一批玉米胚芽的含脂肪量最高(37.24%)， 然而較低于錢志娟等[20]在玉米胚芽水酶法提油及蛋白質的回收中指出的玉米胚芽脂肪(54.62%)含量。錢志娟等[20]的研究還指出，玉米胚芽粗蛋白含量為12.36%，這一結果較低于本試驗結果。么學博等[21]研究得到玉米胚芽餅的脂肪含量是10.10%，較低于本試驗得到的結果；此外，其測得的CP含量較高于本次試驗的第一批玉米胚芽餅，但低于第二批和第三批的含量；然而NDF的含量與本試驗差異較大。林謙等[22]得到在風干基礎上的玉米皮(噴漿)脂肪(EE)含量(分別是1.74%和4.46%)和玉米蛋白粉的脂肪含量(9.31%)均不同于本次研究的結果，導致這種結果的原因可能是不同地區加工工藝流程的不同[3-4]。

3.2 不同批次玉米與其副產品脂質分子結構光譜值

本試驗研究了CH3和CH2不對稱和對稱伸縮帶、不飽和脂質帶(ULB)和脂質羰基酯伸縮帶(LECC)的光譜結構，僅發現在CH3不對稱(CH3-as)，CH2不對稱(CH2-as)，CH3對稱(CH3-s)和CH2對稱(CH2-s)分子結構上飼料的品種與批次之間沒有互作效應(P>0.05)。據先前報道，僅發現玉米與玉米DDGS之間的脂質光譜功能團存在差異[23]，因目前很少報道關于玉米與其副產品脂質結構的分析，故無法進行比較。然而有文獻研究[24-26]報道其他樣品間的脂質功能團結構存在差異，說明FTIR分析技術可用于檢測與脂質相關的分子結構組成變化。

3.3 不同批次玉米與其副產品脂質營養價值與脂質分子結構之間的相關關系

脂質分子結構特性(特征峰的峰高、峰面積以及比值)與脂質營養價值密切相關。在金色亞麻籽與棕色亞麻籽脂質相關結構中，Xin和Yu[12]報道了CH3和CH2對稱伸縮峰高比值與EE呈負相關(r=-0.53)， 但與CH3和CH2不對稱和對稱伸縮帶、不飽和脂質帶(ULB)和脂質羰基酯伸縮帶(LECC)的光譜特征峰的峰高、峰面積呈正相關，這與本試驗的結果相關性一致。Xin等[24]在研究中建立了脂質光譜功能團結構與EE之間的回歸方程，其擬合度高達0.99，證明了脂質分子光譜結構特征與脂肪含量存在相關關系。盡管有關于脂質功能團特征的報道很少，然而采用FTIR光譜技術對飼料營養價值與蛋白質及碳水化合之間相關性的研究很多，例如，丁雪等[27]試驗得出玉米秸稈不同部位的蛋白質營養價值及分子結構存在明顯的差異，并且二者存在顯著的相關關系。飼料脂質分子結構特性分析還有待大量的試驗對其相關性進行驗證。

3.4 不同批次玉米與其副產品的脂質光譜結構多變量分析

本試驗的目的是運用FTIR光譜進行多變量分子分析，快速確定樣品的脂質分子結構。聚類分析是一種多變量分析，對紅外光譜數據集進行聚類分析，并將聚類分析結果顯示為系統樹圖[28]，可以更直觀的區別不同飼料光譜結構。本研究中，使用了內平方距離法(Ward)的算法，在脂質區域中進行光譜數據的參數化。主成分分析是一種統計數據還原方法，PCA分析的結果通常以二維關系圖的形式表示[29]。在本試驗中，不同的樣品其光譜分子結構特征(CH3和CH2不對稱和對稱伸縮帶、ULB和LECC光譜結構)存在差異，以及在批次間存在相似的分子結構。Ban和Yu[30]在利用分子光譜技術對反芻家畜系統中營養物質分子結構進行單變量和多變量分析時也得出類似的分析結果，即不同樣品存在顯著結構差異。在一定程度上，本研究中脂質光譜的多變量分析與單變量分析結果相一致。然而，有報道[26]研究對菜籽油進行干、濕加熱，發現在PCA分析中其分子結構存在大量重疊，說明了強度不足以引起脂質結構的熱誘導變化。在本試驗中，不同批次間飼料樣本同樣存在大量重疊，說明批次間的差異不足以影響其分子光譜結構。

4 結 論

綜上所述，玉米與其副產品的化學成分差異顯著，尤其脂質部分的營養成分(EE)存在明顯的不同，不同批次樣品間有明顯互作效應。利用FTIR分子光譜學研究了玉米與其副產品的脂質光譜分子結構，其中CH2和CH3伸縮帶振動強度沒有顯著互作效應。由CLA和PCA分析得出，在非對稱和對稱的CH3和CH2區域的原始光譜中產生了部分重疊。但是通過多變量分析發現，玉米胚芽(帶殼)與其他飼料樣品的脂質分子結構之間存在著顯著性差異，并且與常規營養價值存在明顯的相關關系，這與飼料間的營養價值密切相關。這種潛在的相關關系可用于飼料分子化學的質量與營養價值判定，然而這還需進一步的研究證明。