HSP70在牦牛腸道中的分布與變化規律

廖 博，崔 燕，楊 雪，何俊峰，宋亮麗，楊曉晴，劉鵬剛

(甘肅農業大學動物醫學院， 蘭州 730070)

腸道是機體最大的消化器官，具有雙重功能，既是營養物質消化、吸收和代謝的重要場所，又是保持機體內環境穩定的先天性屏障[1-2]。對動物的研究發現，在環境因素的影響下，腸道的先天性屏障很容易發生損傷，從而造成腸道菌群的紊亂，進而引發各種疾病導致其生產性能的下降[2]。牦牛常年生活在高寒和缺氧環境，及飼草變化大(嫩草期和枯草期)等多種應激刺激的條件下，依然能夠正常生存與其獨特的腸道內環境和消化機能密不可分[3-4]，因此研究牦牛腸道適應性的分子調控機制顯得非常重要。

熱休克蛋白(HSPs)最初發現是果蠅熱刺激反應的應激蛋白[5]，之后證實在真核和原核生物機體中HSP70存在廣泛的表達[6]。目前所發現的HSPs家族按照相對分子質量大小可分為以下6個家族：小HSP(15～30 ku)、HSP40、HSP60、HSP70、HSP90和HSP100[7]，其中HSP70作為重要的分子伴侶[8]，在細胞中的HSP70能夠協助細胞內其他蛋白質發生正確的轉位、折疊組裝和運輸[9]；還可通過多種途徑與凋亡誘導因子相結合，從而抑制細胞的凋亡[10-11]。現已發現HSP70在多種動物的腸道中有表達，其主要功能是保護腸道細胞免受各種外界的應激刺激[12-15]。目前有關HSP70在腸道中的研究主要集中在受到外界刺激的人[12]、鼠[13]、仔豬[14]和鵝[15]等，而有關健康牦牛腸道中HSP70的定位和表達研究尚未見報道。因此，本研究采用免疫組織化學、蛋白免疫印跡(WB)和實時熒光定量(RT-qPCR)，從蛋白質和基因水平檢測成年牦牛6段腸道中HSP70定位和定量的變化規律，為進一步探討HSP70對牦牛腸道的作用機制提供詳實的參考資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從青海省西寧市采集6頭份健康成年(3～6歲)牦牛腸道組織。在牦牛頸動脈放血致死后，迅速分離出十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸和直腸組織，生理鹽水沖洗干凈之后，將用于制作石蠟切片和免疫組織化學試驗的樣品固定于4%的中性多聚甲醛溶液中。而用于免疫印跡和實時熒光定量試驗的樣品迅速存放于液氮中，次日移至-80 ℃冰箱中備用。

1.2 主要試劑

HSP70(Abcam，ab79852)；HRP(Bioss，bs-0295G)；β-actin (Bioss，bs-0061R)；RIPA(Solarbio，R0010)；PMSF(Solarbio，P0100)；SP試劑盒(Bioss，sp-0023)；DAB試劑盒(ZSGB-bio，ZILZ-9019)。

1.3 組織切片制備

樣品于4%的中性多聚甲醛溶液中固定7 d以上，組織塊經沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋，然后用切片機切成4 μm連續切片。

1.4 免疫組織化學染色

石蠟切片脫蠟至水，免疫組織化學染色按照SP試劑盒說明步驟進行。(1)在pH6.0的0.01 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液中進行熱誘導的微波抗原修復，高火煮沸5 min，然后中火維持3 min，室溫下自然冷卻；(2)滴加3%過氧化氫溶液(來自SP試劑盒)，37 ℃下孵育10 min；(3)滴加10%非免疫性動物血清(SP試劑盒中A液)，室溫孵育10 min，傾去勿洗；(4)每張切片滴加50 μL兔抗HSP70多克隆抗體稀釋液(稀釋度1∶350)，4 ℃過夜；(5)滴加生物素標記的二抗(SP試劑盒中B液)，37 ℃下孵育15 min；(6)滴 加過氧化物酶標記的鏈霉親和素(SP試劑盒中C液)，37 ℃下孵育15 min；(7) DAB顯色，在顯微鏡下觀察并控制顯色，自來水終止反應；(8)蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片。以上步驟除第三步外，其余各步驟間均用PBS洗三次(3 min·次-1)；陰性對照用PBS替代一抗孵育。用Olympus DP73顯微鏡對免疫組織化學染色切片進行觀察并拍照。

1.5 蛋白免疫印跡

將采取的牦牛十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸和直腸六段腸道組織分別研磨后，稱取0.1 g，并按照1 mL RIPA+10 μL PMSF的比例分別加入RIPA和PMSF，勻漿1.5 h，4 ℃下12 000×g離心5 min，取上清液。用ND-1000(Nano Drop Technologies)測定蛋白質濃度后調整蛋白濃度，按蛋白與4×SDS Buffer 3∶1的比例，沸水浴10 min，將蛋白質變性。用等量變性蛋白上樣并進行10% SDS-PAGE電泳，轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。孵育HSP70(1∶1 000)抗體4 ℃過夜，內參為β-actin(1∶1 000)。清洗后的PVDF膜用HRP標記的二抗(1∶2 000)室溫下孵育1 h，用ECL化學發光液顯色并觀察結果。條帶結果采用Image J 軟件測定各條帶灰度值，從而得出HSP70在牦牛各段腸道當中的相對表達量。

1.6 實時熒光定量PCR

1.6.1 引物的設計和合成 根據 GenBank中已報道的牦牛HSP70基因序列及牦牛β-actin內參基因序列，采用Primer Premier 5.0 軟件設計特異性引物，由北京華大基因合成。所用引物見表1。

表1 目的基因和內參基因的引物序列

1.6.2 總RNA的提取、cDNA的合成及PCR擴增 使 用Trizol法提取牦牛六段腸道組織中的總RNA。然后，取不同腸斷中的RNA 5 μL，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性；另取不同腸道組織的RNA 1 μL，使用超微量分光光度計測定其濃度和OD值。將提取的不同組織RNA濃度均調到400 ng·μL-1。根據全式金公司的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉錄試劑盒說明書反轉錄成 cDNA。以反轉錄得到cDNA為模板進行HSP70和β-actin基因的PCR擴增。PCR反應體系為20 μL：上下游引物各1 μL，模板1 μL，GoTaqGreen Master Mix 10 μL，無菌去離子水7 μL。擴增程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 5 min。反應結束后取10 μL PCR產物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，紫外燈下觀察，凝膠成像系統采集圖像。HSP70的PCR擴增產物為158 bp，β-actin的PCR擴增產物為207 bp。

1.7 數據分析

2 結 果

2.1 牦牛腸道中HSP70的免疫組織化學觀察

HSP70在牦牛小腸的黏膜層、黏膜下層和肌層中均有表達(圖1a)，其中小腸黏膜上皮的柱狀細胞呈強陽性表達，杯狀細胞未見表達；小腸腺的腸腺細胞和肌層的平滑肌細胞也呈陽性表達(圖1b～e)，陽性反應主要分布于上述細胞的細胞質與細胞核內。HSP70在大腸中的定位表達與小腸相似，在大腸壁黏膜層、黏膜下層和肌層中也均有表達(圖1g)，但牦牛大腸中HSP70陽性表達主要位于黏膜上皮和固有膜內散在分布的結締組織細胞，固有膜內大腸腺細胞僅在細胞核有表達，細胞質呈陰性(圖1f～h)。來自腸道各段的平均積分光密度的分析結果顯示，HSP70在牦牛的小腸近端至大腸遠端呈現先增高后降低的趨勢，在盲腸達到最高，除盲腸和結腸差異不顯著外(P>0.05)，其余各腸段均差異極顯著(P<0.01) (圖2)。

2.2 牦牛腸道中HSP70蛋白的相對表達

通過蛋白免疫印跡檢測成年牦牛十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸和直腸組織中HSP70的表達，發現從小腸的前端到大腸末端，HSP70的表達呈現先增高后降低的趨勢，其中在盲腸中的表達量達到峰值。此外，由圖3可以看出，HSP70的表達量在大腸中極顯著高于小腸(P<0.01)。

2.3 牦牛腸道中HSP70 mRNA的相對表達

RT-qPCR檢測結果發現，HSP70 mRNA在牦牛的6段腸道內均有表達，直腸和結腸間表達差異不顯著，其他腸段間相對表達量差異顯著(P<0.05)，并且HSP70在盲腸內的表達量顯著高于其他腸段(P<0.05)，分別是十二指、空腸、回腸、結腸和直腸的2、1.68、1.06、1.43和1.52倍(圖4)。

3 討 論

實時熒光定量PCR和蛋白免疫印跡結果顯示，在牦牛十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸和直腸組織中均有HSP70 mRNA和蛋白的表達，說明在正常生理條件下，HSP70基因和蛋白廣泛存在于牦牛的各段腸道中。Hu等[16]研究發現，在健康小鼠的小腸中幾乎檢測不到HSP70的表達，尤其是空腸；而王莉等[17]發現仔豬腹瀉時與健康仔豬消化道組織中的HSP70差異并不顯著。我們的試驗結果與上述試驗結果有所出入，我們推斷可能是由于物種不同及飼料不同引起的HSP70表達出現差異性。令我們欣喜的是，該試驗發現HSP70 mRNA和蛋白的相對表達量在牦牛的6段腸道內，從小腸的前端到大腸末端，HSP70的表達呈現先增高后降低的趨勢，且在盲腸中的表達量最高。前人研究反芻動物證實，盲腸和結腸是機體內除瘤胃外的發酵消化位點，在其中有大量的微生物菌群存在，且在強酸環境的胃和多種微生物存在的大腸中HSP70極顯著表達[18-21]。因此，結合本試驗結果筆者推測，HSP70在牦牛盲腸中的高表達可能與腸道微生物菌群有關，在不同腸段表達的差異性一定程度上反映了牦牛腸道消化機能的強弱。

1.十二指腸；2.空腸；3.回腸；4.盲腸；5.結腸；6.直腸。不同小寫字母代表組間差異極顯著(P<0.01)，相同小寫字母代表組間差異不顯著(P>0.05)1.Duodenum；2.Jejunum；3.Ileum；4.Cecum；5.Colon；6.Rectum. The different letters mean significant differences between the groups (P<0.01), the same letters mean no significant differences between the groups (P>0.05)圖2 HSP70在牦牛腸道中的平均積分光密度Fig.2 Average integrated optical density of HSP70 in yak intestine

1.十二指腸；2.空腸；3.回腸；4.盲腸；5.結腸；6.直腸。不同小寫字母代表組間差異極顯著(P<0.01)1. Duodenum；2. Jejunum；3. Ileum；4. Cecum；5. Colon；6. Rectum. The different letters mean significant differences between the groups (P<0.01)圖3 HSP70蛋白的相對表達水平Fig.3 Relative expression levels of HSP70

M. DL2000 DNA相對分子質量標準；1.十二指腸；2.空腸；3.回腸；4.盲腸；5.結腸；6.直腸；不同小寫字母代表組間差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母代表組間差異不顯著(P>0.05)M. DL2000 DNA marker; 1. Duodenum；2. Jejunum；3. Ileum；4. Cecum；5. Colon；6. Rectum; The different letters mean significant differences between the groups (P<0.05), the same letters mean no significant differences between the groups (P>0.05)圖4 HSP70在牦牛腸道中的實時熒光定量PCRFig.4 RT-qPCR results of HSP70 gene in yak intestine

本試驗中，通過對HSP70在健康牦牛腸道中的定位表達的研究，筆者發現HSP70在正常的牦牛各段腸道中均有表達，但在牦牛小腸和大腸中的表達模式并不完全相同。在牦牛小腸中，HSP70的陽性表達主要見于黏膜上皮、小腸腺和肌層，在黏膜固有層的結締組織僅有微弱的表達；而在牦牛大腸中，HSP70的陽性表達主要見于黏膜上皮、固有層結締組織和肌層，大腸腺腺細胞核中也有陽性反應。我們還發現HSP70在牦牛大腸固有層結締組織細胞的細胞核中有強烈表達。有研究發現，HSP70參與機體的免疫，屬于HSP70的特殊結構蛋白BIP在免疫球蛋白的合成過程中起到關鍵的作用[22]。一般情況下，HSP70位于細胞質內，當細胞遭受應激作用時，HSP70會迅速移入細胞核內并包圍核仁；而應激消除后細胞處于恢復階段時，細胞核內HSP70又返回細胞質，再次應激又重新返回細胞核[23]。結合腸道的組織學特點，這表明HSP70有可能在牦牛腸道的免疫屏障中發揮著重要作用。有研究報道發現，來自于腸道內容物中的細菌和內毒素等能夠在腸道屏障損傷后發生細菌和LPS的移位，進而造成嚴重的炎癥反應，并引發腸道細胞過度凋亡[24-25]。Watanabe等[26]和Oyake等[27]發現HSP70能夠保護胃腸道上皮在潰瘍和有毒物質的影響下維持其正常的生理狀態。同時，Pierzchalski等[28]也發現HSP70的過度表達還可以抑制細胞的凋亡，加速蛋白合成和促進細胞增殖來加速潰瘍的愈合速度。因此，綜合HSP70在牦牛腸道中的表達特點，我們認為牦牛腸道中HSP70的表達能夠保護腸道細胞免受外來刺激、抑制其凋亡以及保護細胞的正常生理狀態。

筆者分析了HSP70在牦牛腸道三種分泌細胞中的表達模式，發現在小腸腺細胞細胞質和細胞核中均呈強陽性，大腸腺細胞中僅見細胞核陽性，在杯狀細胞中呈陰性。牛的小腸腺主要是分泌消化酶，大腸腺分泌的堿性黏液主要是中和其腸腔內的酸性物質，且其中不含消化酶[29]。而杯狀細胞的主要分泌物——黏蛋白是腸道的保護蛋白[30]。HSP70作為分子伴侶能夠維持和穩定蛋白前體的基本構象，可以使蛋白保持一種松弛的伸展開來的結構，以便進行蛋白的跨膜轉運，在協助蛋白進行跨膜轉運等方面發揮著重要作用[9]。黃芬等[31]發現過表達的HSP70能有效促進細胞分泌性蛋白的表達。結合腸道細胞中三種分泌蛋白的表達模式，推測HSP70有可能促進小腸腺消化蛋白酶的分泌，預示著HSP70可能和腸道正常消化相關，其具體機制有待進一步研究。

4 結 論

HSP70在牦牛腸道中存在廣泛性陽性反應，基因和蛋白表達顯示在小腸和大腸中呈顯著性差異，且在盲腸中表達顯著高于其他腸段。結果表明HSP70與牦牛腸道的消化吸收功能有著密切的關聯性。