沙冬青種子總黃酮對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能及胸腺和脾超微結(jié)構(gòu)的影響

黃偉寬，劉瑞菊，賈 寧*，方 梅，陶 波,3，張嘉男，梁鵬飛，鄧 康

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2.山東省壽光市營(yíng)里鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)管理站，壽光 262700；3.臨夏現(xiàn)代職業(yè)學(xué)院，臨夏 731100)

黃酮類化合物(flavonoids)是指兩苯環(huán)(A環(huán)與B環(huán))通過(guò) C3 聯(lián)接而成的一系列化合物，其廣泛分布于蕓香科、菊科、玄參科等科屬的植物中。已有研究表明[1-3]，黃酮類化合物具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多種生物學(xué)活性，已成為天然藥物中重要的生物活性成分之一。

沙冬青(Ammopiptanthus)為豆科旱生植物，是亞洲荒漠區(qū)所特有的常綠灌木，有蒙古沙冬青(A.mongolicus)和新疆沙冬青(A.nanus)2個(gè)物種[4]。在我國(guó)，沙冬青主要分布于內(nèi)蒙古、寧夏、甘肅等地[4-5]。已有研究證明，沙冬青種子中含有較豐富的黃酮類化合物，沙冬青種子總黃酮是從沙冬青種子中分離、提取的總酮。陳慧等、周建勝等[4-5]分別報(bào)道了沙冬青種子總黃酮的抗病毒活性。陶波等[6]初步報(bào)道了沙冬青種子總黃酮具有重要的免疫活性。但到目前為止，有關(guān)沙冬青種子總黃酮對(duì)免疫抑制動(dòng)物的免疫功能調(diào)節(jié)和免疫器官超微結(jié)構(gòu)的影響尚未見報(bào)道。本研究旨在深入探索沙冬青種子總黃酮對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用和對(duì)其胸腺、脾超微結(jié)構(gòu)的影響，從而為充分有效地利用和開發(fā)沙冬青資源，尋找安全、可靠、純天然新型獸用免疫增強(qiáng)和調(diào)節(jié)劑，提供十分重要的基礎(chǔ)資料和形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

沙冬青種子：購(gòu)自甘肅省民勤縣種子公司，經(jīng)洗凈、曬干、粉碎備用。沙冬青種子總黃酮：由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所分離、提取與純化，結(jié)合陳慧等[4]及陶波等[6]的純化方案，經(jīng)反復(fù)純化，最終純化物中總黃酮含量為86.87%。

1.2 主要儀器與試劑

JA2003N型電子天平(北京北科恒信科學(xué)器材有限公司)；Multiskan MK3型酶標(biāo)儀(美國(guó))；MSP-1S型數(shù)字化掃描電子顯微鏡(日本)；FD-1B-50真空冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；KQ-300DE型數(shù)據(jù)超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DFT-250手提式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；IL-2、IL-4檢測(cè)試劑盒(北京安迪華泰科技有限公司)；環(huán)磷酰胺(CTX)(試劑級(jí)，大連美侖生物技術(shù)有限公司)。戊二醛、羧甲基纖維素鈉、叔丁醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物分組與試驗(yàn)

100只20日齡清潔級(jí)昆明種小鼠購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重18～21 g。 飼養(yǎng)于清潔的動(dòng)物房，自由采食和飲水，自然光照，室溫在22 ℃左右。進(jìn)行3 d適應(yīng)觀察后分組。

將100只小鼠隨機(jī)分成5組(雌雄各半)：空白對(duì)照組、免疫抑制組、試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組，每組20只(雌雄各半)。動(dòng)物分組后，分2步進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)：

全部動(dòng)物試驗(yàn)共計(jì)28 d。前7 d，空白對(duì)照組小鼠灌胃0.6 mL·d-1生理鹽水，免疫抑制組、試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組與試驗(yàn)Ⅲ組小鼠均灌胃0.6 mL CTX溶液[劑量40 mg·(kg·d)-1]。后21 d，除空白對(duì)照組小鼠繼續(xù)灌胃生理鹽水外，免疫抑制組小鼠改灌胃0.6 mL·d-1生理鹽水，試驗(yàn)Ⅰ組小鼠改灌胃0.6 mL總黃酮溶液[劑量50 mg·(kg·d)-1]， 試驗(yàn)Ⅱ組小鼠改灌胃0.6 mL總黃酮溶液[劑量150 mg·(kg·d)-1]，試驗(yàn)Ⅲ組小鼠改灌胃0.6 mL總黃酮溶液[劑量250 mg·(kg·d)-1]。試驗(yàn)期間所有小鼠自由采食和飲水，仔細(xì)觀察小鼠狀況(活動(dòng)、精神、采食、飲水等)，每天稱小鼠體重。末次給藥24 h后，分別進(jìn)行碳粒廓清試驗(yàn)、臟器指數(shù)測(cè)定、血清IL-2和IL-4含量測(cè)定。同時(shí)，采集小鼠胸腺和脾，2.5%戊二醛固定，待制備掃描電鏡樣品。

1.4 碳粒廓清指數(shù)和胸腺、脾指數(shù)測(cè)定

末次給藥24 h后，對(duì)小鼠空腹稱重，然后給小鼠尾靜脈注射印度墨汁(0.01 mL·g-1)，分別在2(T1)、12 min(T2)后摘眼球采血，然后迅速加入4 mL 0.1%Na2CO3充分搖勻后，以0.1% Na2CO3溶液作為空白對(duì)照，在630 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值(OD)，用以下公式分別計(jì)算碳粒廓清指數(shù)(K)、吞噬指數(shù)(α)的值：

采血后，剖檢小鼠，取肝、胸腺和脾，除去多余結(jié)締組織和脂肪，稱重計(jì)算胸腺(A)和脾(B)指數(shù)：

A=小鼠胸腺質(zhì)量/小鼠空腹體重；B=小鼠脾質(zhì)量/小鼠空腹體重。

1.5 血清IL-2、IL-4測(cè)定

末次給藥24 h后，摘眼球采血置于2 mL無(wú)抗凝劑EP管中，室溫靜置15 min使其凝固，2 000 r·min-1離心 20 min。收集上層血清，將其分裝后置-20 ℃冰箱凍存，待測(cè)血清樣本中細(xì)胞因子。IL-2和IL-4測(cè)定，嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值(OD)，將測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 掃描電鏡樣本制備與觀察

小鼠剖檢后，采集胸腺和脾，用鋒利刀片將胸腺和脾切成0.3 cm×0.5 cm大小的方塊，采用生理鹽水清洗組織塊表面的血污，再放入盛有2.5%戊二醛小瓶?jī)?nèi)固定12 h。然后，倒掉戊二醛，用生理鹽水清洗瓶?jī)?nèi)的組織2～3次(將遺留在組織上的戊二醛洗凈)。洗凈組織后，用30%、50%、70%、80%、90%、100%的乙醇依次梯度脫水，各乙醇濃度脫水時(shí)間均為1 h。脫水后，將乙醇倒出，向瓶?jī)?nèi)加入叔丁醇，放置于-20 ℃的冰箱內(nèi)冷凍2 h，再進(jìn)行冷凍真空干燥24 h。采用數(shù)字掃描電子顯微鏡觀察、拍照，同時(shí)，每個(gè)掃描電鏡樣本在放大1 000倍下，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié) 果

2.1 沙冬青種子總黃酮對(duì)免疫抑制小鼠胸腺和脾指數(shù)的影響

根據(jù)測(cè)定結(jié)果顯示(表1)，免疫抑制組小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)平均數(shù)分別為(2.13±0.17)和(3.24±0.36) mg·g-1，其數(shù)值顯著低于對(duì)應(yīng)空白對(duì)照組，差異極顯著(P<0.01)。證明CTX對(duì)小鼠脾、胸腺的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生了明顯抑制作用，免疫抑制模型的復(fù)制是成功的。與免疫抑制組比較，沙冬青種子總黃酮試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)平均數(shù)均明顯增高，增高程度不盡相同。尤其試驗(yàn)Ⅱ組[總黃酮灌胃劑量150 mg·(kg·d)-1]小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)平均數(shù)增高最顯著，分別達(dá)到(3.26±0.22)和(4.63±0.57) mg·g-1，與免疫抑制組比較差異極顯著(P<0.01)。

2.2 沙冬青種子總黃酮對(duì)免疫抑制小鼠碳粒廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)的影響

測(cè)定結(jié)果顯示(表2)，免疫抑制組小鼠碳粒廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)平均數(shù)分別為0.01±0.00和3.98±0.16，其數(shù)值顯著低于對(duì)應(yīng)空白對(duì)照組，差異也極顯著(P<0.01)。證明CTX對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生及其吞噬功能產(chǎn)生了明顯抑制作用，也表明免疫抑制模型復(fù)制成功。沙冬青種子總黃酮試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組小鼠的碳粒廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)平均數(shù)與免疫抑制組小鼠比較則有不同程度提高。尤其試驗(yàn)Ⅱ組[總黃酮灌胃劑量150 mg·(kg·d)-1]小鼠碳粒廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)平均數(shù)提高最顯著，分別達(dá)到0.02±0.01和4.69±0.33，與免疫抑制組比較差異極顯著(P<0.01)。

2.3 沙冬青種子總黃酮對(duì)免疫抑制小鼠血清IL-2、IL-4含量的影響

測(cè)定結(jié)果顯示(表3)，免疫抑制組小鼠血清IL-2、IL-4含量分別為(466.50±52.32)和(35.68±2.10) pg·mL-1，其含量顯著低于對(duì)應(yīng)空白對(duì)照組，差異極顯著(P<0.01)。證明CTX對(duì)小鼠免疫功能產(chǎn)生明顯抑制，導(dǎo)致血清IL-2、IL-4含量大大降低。沙冬青種子總黃酮試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組小鼠血清IL-2、IL-4含量與免疫抑制組小鼠比較也有不同程度升高。尤其試驗(yàn)Ⅱ組[總黃酮灌胃劑量150 mg·(kg·d)-1]小鼠血清IL-2、IL-4含量升高最突出，分別達(dá)到(541.30±33.41)和(44.82±2.26)pg·mL-1，與免疫抑制組比較差異極顯著(P<0.01)。

表1 沙冬青種子總黃酮對(duì)免疫抑制小鼠脾和胸腺指數(shù)的影響

與空白對(duì)照組比較，ΔΔ.P<0.01；與免疫抑制組比較，*.P<0.05，**.P<0.01

Compared with normal control group,ΔΔ.P<0.01; Compared with immunosuppression group,*.P<0.05,**.P<0.01

表2 沙冬青種子總黃酮對(duì)免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞及其吞噬功能的影響

與空白對(duì)照組比較，ΔΔ.P<0.01；與免疫抑制組比較，*.P<0.05，**.P<0.01

Compared with normal control group,ΔΔ.P<0.01; Compared with immunosuppression group,*.P<0.05,**.P<0.01

表3 沙冬青種子總黃酮對(duì)免疫抑制小鼠血清IL-2、IL-4含量的影響

與空白對(duì)照組比較，ΔΔ.P<0.01；與免疫抑制組比較，*.P<0.05，**.P<0.01

Compared with normal control group,ΔΔ.P<0.01; Compared with immunosuppression group,*.P<0.05,**.P<0.01

2.4 沙冬青種子總黃酮對(duì)免疫抑制小鼠胸腺超微結(jié)構(gòu)的影響

小鼠胸腺髓質(zhì)掃描電鏡觀察(表4，圖1)顯示，胸腺淋巴細(xì)胞呈圓形或不正圓形。免疫抑制組小鼠胸腺淋巴細(xì)胞數(shù)量與對(duì)應(yīng)空白對(duì)照組比較明顯減少(P<0.01)，且淋巴細(xì)胞排列明顯稀疏、散亂，許多淋巴細(xì)胞與周圍間質(zhì)脫離，使局部間質(zhì)形成許多凹陷或空洞。同時(shí)，與空白對(duì)照組比較，免疫抑制模型組小鼠胸腺小葉體積明顯縮小，小葉間隔內(nèi)纖維結(jié)締組織增多。因此，從形態(tài)學(xué)上證明CTX對(duì)小鼠胸腺的發(fā)育和淋巴細(xì)胞的成熟產(chǎn)生明顯抑制。

沙冬青種子總黃酮試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組小鼠胸腺淋巴細(xì)胞數(shù)量與免疫抑制模型組小鼠胸腺比較都有不同程度增加。尤其試驗(yàn)Ⅱ組[總黃酮灌胃劑量150 mg·(kg·d)-1]小鼠胸腺淋巴細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，與免疫抑制組比較差異極顯著(P<0.01)。同時(shí)，與免疫抑制模型組小鼠比較，試驗(yàn)Ⅱ組小鼠胸腺組織發(fā)育最好，小葉明顯增大、清晰，淋巴細(xì)胞排列緊密，與周圍組織之間間隙明顯減少，很少出現(xiàn)淋巴細(xì)胞從周圍組織脫落現(xiàn)象，在同樣放大倍數(shù)下，淋巴細(xì)胞體積相對(duì)較大，成熟較好。

表4 沙冬青種子總黃酮對(duì)免疫抑制小鼠胸腺、脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

與空白對(duì)照組比較，ΔΔ.P<0.01；與免疫抑制組比較，*.P<0.05，**.P<0.01.電鏡觀察倍數(shù)1 000×

Compared with normal control group,ΔΔ.P<0.01; Compared with immunosuppression group,*.P<0.05,**.P<0.01.Magnification ti mes, 1 000×

2.5 沙冬青種子總黃酮對(duì)免疫抑制小鼠脾超微結(jié)構(gòu)的影響

小鼠脾掃描電鏡觀察(表4，圖2)顯示，小鼠脾脾索與脾竇相間排列。脾索內(nèi)，網(wǎng)狀細(xì)胞凸起相互連接呈網(wǎng)狀支架，其上有不同發(fā)育階段淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等貼附于網(wǎng)狀支架上。脾竇由棱形或短桿狀內(nèi)皮細(xì)胞平行排列構(gòu)成。與胸腺掃描電鏡相似，免疫抑制組小鼠脾淋巴細(xì)胞數(shù)量與空白對(duì)照組比較明顯減少(P<0.01)，且淋巴細(xì)胞排列稀疏、散亂、體積相對(duì)較小，許多淋巴細(xì)胞從網(wǎng)狀支架脫落，使局部間質(zhì)網(wǎng)狀支架裸露，形成許多孔洞或只有紅細(xì)胞附著，甚至間質(zhì)網(wǎng)狀支架內(nèi)纖維結(jié)締組織增生。觀察結(jié)果也從形態(tài)學(xué)上證明CTX對(duì)小鼠脾的發(fā)育和淋巴細(xì)胞的成熟產(chǎn)生明顯抑制作用。

沙冬青種子總黃酮試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組小鼠脾淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量與免疫抑制組小鼠脾比較均有不同程度增加。尤其試驗(yàn)Ⅱ組[總黃酮灌胃劑量150 mg·(kg·d)-1]小鼠脾淋巴細(xì)胞數(shù)量的增加最為顯著，與免疫抑制組比較差異極顯著(P<0.01)，且淋巴細(xì)胞排列緊密，與周圍間質(zhì)網(wǎng)狀支架間隙明顯減少，也很少出現(xiàn)淋巴細(xì)胞脫落現(xiàn)象，淋巴細(xì)胞體積相對(duì)較大，成熟良好。

3 討 論

3.1 免疫抑制及環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠免疫抑制

動(dòng)物機(jī)體的免疫系統(tǒng)是由非特異性免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫共同構(gòu)成的防御體系。正常機(jī)體免疫系統(tǒng)可通過(guò)識(shí)別、吞噬、抗原呈遞、激活淋巴細(xì)胞、分泌細(xì)胞因子、產(chǎn)生相應(yīng)抗體等多種方式對(duì)入侵機(jī)體的病原微生物和體內(nèi)產(chǎn)生的異常細(xì)胞等進(jìn)行清除和殺滅[7-9]。因此，機(jī)體免疫系統(tǒng)的狀況在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和各器官功能正常發(fā)揮中具有十分重大的意義。免疫抑制是機(jī)體非特異免疫功能異常的一種現(xiàn)象，表現(xiàn)為機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)抗原信息的刺激應(yīng)答反應(yīng)遲緩、滯后，甚至不產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)。免疫抑制動(dòng)物從免疫器官的發(fā)育，到體內(nèi)各種免疫功能指標(biāo)均大大低于正常動(dòng)物[10-13]。已有研究表明[9-11，14-15]，動(dòng)物機(jī)體免疫器官質(zhì)量的降低是免疫器官被抑制，功能降低的重要表現(xiàn)。Corbin等[14]研究認(rèn)為，采用脾等免疫器官的質(zhì)量能可靠判定免疫系統(tǒng)活力和強(qiáng)度。此外，單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)對(duì)外來(lái)病原和異物的吞噬和清除功能則是機(jī)體非特異性免疫反應(yīng)的重要特征。IL-2和IL-4是重要的淋巴細(xì)胞因子，其在血清中含量的多少反映出機(jī)體淋巴細(xì)胞活性和細(xì)胞免疫功能的強(qiáng)弱[15-21]。

a1、a2、a3. 空白對(duì)照組(1 000×、2 500×和5 000×)；b1、b2、b3. 免疫抑制組(1 000×、2 500×和5 000×)；c1、c2、c3. 試驗(yàn)Ⅱ組[總黃酮灌胃劑量150 mg·(kg·d)-1](1 000×、2 500×和5 000×)。與空白對(duì)照組比較，免疫抑制組脾淋巴細(xì)胞明顯減少，間質(zhì)網(wǎng)狀支架裸露；試驗(yàn)Ⅱ組與免疫抑制組比較，脾淋巴細(xì)胞則明顯增多、成熟，且排列緊密a1, a2, a3. Normal control group (1 000×, 2 500× and 5 000×)；b1, b2, b3. Immunosuppression group (1 000×, 2 500× and 5 000×)；c1, c2, c3. Test groupⅡ (1 000×, 2 500× and 5 000×). Compared with the normal control group，the lymphocytes are reduced greatly in immunosuppressed mice spleen of the immunosuppression group，and the interstitial reticular scaffold are exposed. Compared with the immunosuppression group，the number of mature lymphocytes in mice spleen increased significantly in the test groupⅡ圖2 沙冬青種子總黃酮對(duì)免疫抑制小鼠脾超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effect of total flavonoids from Ammopiptanthus mongolicus on the ultrastructure of spleen in immunosuppressed mice

環(huán)磷酰胺(CTX)是已知的化學(xué)免疫抑制劑，采用CTX可建立免疫抑制動(dòng)物模型[15]。本試驗(yàn)研究中，給小鼠灌胃 CTX[40 mg·(kg·d)-1]一周后，也建立起了良好的小鼠免疫抑制模型。與空白對(duì)照組比較，免疫抑制組小鼠從脾和胸腺指數(shù)、碳粒廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)到血清IL-2和IL-4含量均極顯著低于空白對(duì)照組(P<0.01)。試驗(yàn)再次證明，采用CTX灌胃給藥后，導(dǎo)致小鼠免疫器官發(fā)育受阻和免疫功能嚴(yán)重低下，建立起了良好的小鼠免疫抑制模型。

3.2 沙冬青種子總黃酮對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能的影響

已有研究表明[1-11，14-17]，黃酮類化合物具有免疫增強(qiáng)和調(diào)節(jié)作用。黃酮類化合物可以通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的成熟與活化來(lái)提高機(jī)體的免疫功能。淫羊藿總黃酮(TFE)可明顯增強(qiáng)氫化可的松和羥基脲所致免疫抑制模型小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞的活性和吞噬功能[1-2]。槲皮素(黃酮)可以促進(jìn)氫化可的松免疫抑制模型小鼠體內(nèi)淋巴細(xì)胞增殖，顯著提高小鼠體內(nèi)IL-2的產(chǎn)生和活性，對(duì)免疫抑制具有明顯改善[1-2,9,11,19]。本研究發(fā)現(xiàn)，沙冬青種子總黃酮能顯著提高CTX誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)、碳粒廓清指數(shù)、吞噬指數(shù)以及血清IL-2和IL-4含量，尤其在總黃酮灌胃劑量150 mg·(kg·d)-1時(shí)，免疫抑制小鼠的上述測(cè)定指標(biāo)均得到了顯著改善和提高，與免疫抑制組小鼠差異極顯著(P<0.01)。研究結(jié)果證實(shí)，沙冬青種子總黃酮可明顯促進(jìn)和改善免疫抑制小鼠免疫功能的恢復(fù)。其中，試驗(yàn)Ⅱ組[總黃酮灌胃劑量150 mg·(kg·d)-1]的改善和促進(jìn)作用最突出。同時(shí)，在一定灌胃劑量范圍內(nèi)，沙冬青種子總黃酮促進(jìn)和改善免疫抑制小鼠免疫功能的作用效果隨總黃酮灌胃劑量的增加而升高，呈正相關(guān)性，如從試驗(yàn)Ⅰ組[總黃酮灌胃劑量50 mg·(kg·d)-1]到試驗(yàn)Ⅱ組[總黃酮灌胃劑量150 mg·(kg·d)-1]各項(xiàng)免疫功能檢測(cè)指標(biāo)均隨總黃酮作用劑量的增加而升高。當(dāng)沙冬青種子總黃酮灌胃劑量超出一定范圍后，如試驗(yàn)Ⅲ組[總黃酮灌胃劑量250 mg·(kg·d)-1]，各項(xiàng)免疫功能檢測(cè)指標(biāo)并不隨灌胃劑量的增加而進(jìn)一步升高，表明沙冬青種子總黃酮對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能的改善作用有其最適作用劑量。

3.3 沙冬青種子總黃酮對(duì)免疫抑制小鼠免疫器官結(jié)構(gòu)的影響

胸腺(thymus)是動(dòng)物機(jī)體重要的中樞淋巴器官，而脾(spleen)是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)最大的淋巴器官。大量資料顯示[8-11，14-19]，胸腺和脾在動(dòng)物機(jī)體正常免疫功能的建立和免疫功能受損之后的修復(fù)和改善中起著十分重要的作用。胸腺實(shí)質(zhì)主要由上皮性網(wǎng)狀細(xì)胞構(gòu)成支架，其內(nèi)含大量不同分化階段的淋巴細(xì)胞(胸腺細(xì)胞)[11,16]。脾是血液循環(huán)中的重要濾過(guò)器官，脾索內(nèi)網(wǎng)狀細(xì)胞凸起呈絲狀連接，其上有不同發(fā)育階段的血細(xì)胞；內(nèi)皮細(xì)胞圍成的脾竇內(nèi)也有大量不同發(fā)育階段的血細(xì)胞[11,15-16]。已有研究表明[11,16]，CTX可使免疫抑制小鼠免疫器官淋巴細(xì)胞數(shù)目明顯減少。本研究也觀察到，免疫抑制組小鼠胸腺和脾實(shí)質(zhì)中淋巴細(xì)胞數(shù)量與對(duì)應(yīng)空白對(duì)照組比較都極顯著減少(P<0.01)，且淋巴細(xì)胞排列稀疏、散亂，甚至與周圍間質(zhì)脫離致局部形成凹陷或孔洞等，后期間質(zhì)結(jié)締組織增生。因此，從超微結(jié)構(gòu)證實(shí)胸腺和脾成熟淋巴細(xì)胞數(shù)量的大大減少是免疫抑制小鼠免疫功能低下的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)之一。

王洪武等[8]研究表明，淫羊藿總黃酮是通過(guò)大量增加脾中淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫相關(guān)細(xì)胞的數(shù)量來(lái)改善和提高免疫抑制小鼠的免疫功能。本試驗(yàn)研究也表明，沙冬青種子總黃酮對(duì)免疫抑制小鼠胸腺、脾的發(fā)育具有明顯改善和促進(jìn)作用，可顯著促進(jìn)胸腺、脾淋巴細(xì)胞的顯著增殖和成熟。其中，在試驗(yàn)Ⅱ組[總黃酮灌胃劑量150 mg·(kg·d)-1]，小鼠胸腺與脾成熟淋巴細(xì)胞的數(shù)量顯著增多，與免疫抑制組比較差異極顯著(P<0.01)，且組織結(jié)構(gòu)也得到極大的恢復(fù)和改善，淋巴細(xì)胞排列緊密，與周圍間質(zhì)間隙明顯減少，淋巴細(xì)胞脫落現(xiàn)象明顯減少等。

因此，綜合分析以上結(jié)果，沙冬青種子總黃酮對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能具有明顯改善、恢復(fù)和促進(jìn)作用，這種作用是通過(guò)促進(jìn)免疫器官淋巴細(xì)胞的增殖和成熟，修復(fù)受損免疫器官組織結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，沙冬青種子總黃酮的上述作用效果在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴效應(yīng)。而關(guān)于沙冬青種子總黃酮如何誘導(dǎo)免疫抑制小鼠胸腺、脾淋巴細(xì)胞增殖和成熟的機(jī)制還有待深入研究。

4 結(jié) 論

沙冬青種子總黃酮可通過(guò)促進(jìn)免疫器官淋巴細(xì)胞的增殖和成熟，修復(fù)受損免疫器官組織結(jié)構(gòu)來(lái)改善和促進(jìn)免疫抑制小鼠免疫功能的恢復(fù)。沙冬青種子總黃酮的免疫增強(qiáng)作用在一定范圍內(nèi)具有劑量依賴效應(yīng)。