直立黃芪中產苦馬豆素真菌的分離與鑒定

余永濤，李金榮，趙清梅，何生虎，陳 娟，楊 奇，毛彥妮

(1. 寧夏大學農學院，銀川 750021； 2. 北方民族大學生物科學與工程學院，銀川 750021；3. 國家民委發酵釀造工程生物技術重點實驗室，銀川 750021； 4. 寧夏回族自治區獸藥飼料監察所，銀川 750011)

直立黃芪(AstragalusadsurgensPall)又稱斜莖黃耆，人工培育品種又稱沙打旺[1]。該植物是豆科黃芪屬多年生草本植物，在俄羅斯、蒙古、中國、北美、澳大利亞等地區均有分布[2-3]。野生型直立黃芪在我國廣泛分布于黑龍江、內蒙古、甘肅、寧夏、西藏等地區[4]。因其環境適應性強，抗寒耐旱，耐鹽堿，富含營養等特點，自20世紀70年代以來，直立黃芪被馴化為人工牧草在我國大面積種植。但在美國、澳大利亞等國家，因其含有吲哚里西啶生物堿苦馬豆素(Swainsonine，SW)、脂肪族硝基化合物等毒性成分，被劃分為瘋草(豆科棘豆屬和黃芪屬有毒植物的統稱)[3,5]。研究表明，我國直立黃芪含有微量脂肪族硝基化合物，屬于低毒植物，經長期馴化培養的人工栽培品種可安全飼喂反芻動物，但可引起單胃動物中毒[6]。目前仍不清楚脂肪族硝基化合物是否是我國直立黃芪引起動物中毒的主要原因。苦馬豆素是諸多黃芪屬瘋草的主要毒性成分，可抑制哺乳動物細胞內溶酶體α-甘露糖苷酶和高爾基體甘露糖苷酶Ⅱ的活性，導致低聚糖代謝和糖蛋白合成障礙，造成細胞空泡變性和組織器官功能紊亂[7]。目前北美地區已確定含有苦馬豆素的黃芪屬植物約有30余種[8-9]，我國有2種，分別是變異黃芪和莖直黃芪[10]。我國直立黃芪中是否也含有苦馬豆素仍未見報道。

大量研究表明，黃芪屬和棘豆屬瘋草中普遍存在能產生苦馬豆素的鏈格孢屬波狀芽管孢組內生真菌(AlternariaSectionUndifilumsp.),該類真菌與瘋草共生，是瘋草中苦馬豆素產生的主要因素[11-14]。酵母氨酸氧化酶基因、β-酮脂酰合酶(β-ketoacyl synthase，KS)基因在瘋草內生真菌合成苦馬豆素的過程中發揮著重要的調控作用[15-16]。目前人們在中國和美國含有苦馬豆素的主要黃芪屬瘋草中均分離或檢測到鏈格孢屬波狀芽管孢組內生真菌[10, 17]。近年來，李彥忠(Li)等[18]從直立黃芪中分離到一類與鏈格孢屬波狀芽管孢組真菌形態非常相似的真菌，該真菌在葉、莖、種子中的分離情況與瘋草內生真菌在瘋草中的分布情況相似，該菌被認為是導致直立黃芪根莖腐爛和早衰的主要原因之一。根據形態，李彥忠(Li)等[19]將其初步命名黃芪埃里磚格孢(Embellisiaastragali)。劉建利(Liu)等[20]進一步研究表明，黃芪埃里磚格孢與瘋草內生真菌遺傳進化關系緊密，根據GPD、RPB2、TEF-1等序列的遺傳進化分析結果，將黃芪埃里磚格孢進一步命名為甘肅鏈格孢(Alternariagansuense)。但以上研究均未確定甘肅鏈格孢能否產生苦馬豆素，直立黃芪中是否普遍存在甘肅鏈格孢。直立黃芪廣泛分布于我國各省區，人工種植面積大，搞清楚甘肅鏈格孢在直立黃芪中的分布情況，確定其是否產生苦馬豆素，可為直立黃芪的安全利用提供重要依據。

本研究擬對直立黃芪植物組織中的真菌進行分離，調查各類真菌在直立黃芪中的分布情況；采用α-甘露糖苷酶抑制法和超高效液相色譜-串聯質譜法對直立黃芪及從中分離的菌株化學成分進行分析，確定直立黃芪中是否存在產苦馬豆素真菌；擴增和測定產苦馬豆素菌株ITS、GPD、KS等序列，并基于該序列信息對其進行遺傳進化分析，根據形態和遺傳進化分析結果對其分類鑒定。本研究可為進一步闡明甘肅鏈格孢與直立黃芪、瘋草內生真菌的關系，及直立黃芪的安全利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1植物材料 眼觀無病變的全株直立黃芪，于2017年8月采自甘肅省環縣草原實驗站及甘肅省天祝藏族自治州抓喜秀龍牧場，共12株，樣品采集后根部用無菌的濕紙巾包裹，放入冰盒中于24 h內帶回實驗室進行真菌的分離。

1.1.2 對照菌株AlternariaSectionUndifilumOxytropisNX-FEL001菌株，分離自黃花棘豆；AlternariaSectionUndifilumOxytropisNM-UA003菌株，分離自變異黃芪，由本實驗室分離鑒定并保存。

1.1.3 培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，氯霉素50 mg·L-1， 濾液補足至1 L，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。PCA培養基：馬鈴薯20 g，胡蘿卜20 g，瓊脂20 g，氯霉素50 mg·L-1，濾液補足至1 L，121 ℃高 壓蒸汽滅菌30 min。

1.1.4 試劑和儀器 苦馬豆素(SW)標準品，由寧夏大學農學院臨床獸醫學重點學科實驗室從變異黃芪中分離和純化(GC≥98%)；DNA提取試劑盒購自OMEGA公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒和DNA聚合酶等分子生物學試劑均購自大連寶生物工程有限公司；α-甘露糖苷酶和4-Nitrophenyl α-D-mannopyranoside購自美國Sigma公司；其他有機試劑均為國產色譜純或分析純。PCR儀、凝膠成像系統均購自Bio-Rad公司；MK3酶標儀，美國賽默飛世爾公司；Waters UPLC/TQ-S micro超高效液相色譜-串聯質譜分析系統，美國Waters公司。

1.2 方法

1.2.1 真菌的分離 用自來水將全株直立黃芪沖洗干凈，然后用滅菌剪刀將植物的葉、莖、種子、根分離，參照李彥忠(Li)等[19]的方法對其進行表面消毒：70%的乙醇浸泡30 s，1%的次氯酸鈉溶液浸泡3 min， 無菌水漂洗2次，無菌濾紙吸干。在無菌條件下，將各組織接種于PDA培養基平板上。置于20 ℃ 恒溫黑暗培養，待組織周圍長出真菌后，挑取每個菌落邊緣菌絲重新接種到新的PDA培養基中反復分離培養，直至得到純化的菌株，對純化的菌株依次編號。

1.2.2 真菌的形態觀察與初步分類 已經純化的真菌接種于PDA平板上培養2～4周，挑取菌落邊緣菌絲于載玻片上，以棉蘭乳酸酚或水為浮載劑，顯微鏡下觀察并記錄分生孢子及分生孢子梗的形態特征，根據真菌的形態對其進行初步分類。對于不產生分生孢子的真菌，分別采用紫外線照射、掃刷營養體等方法誘導產孢[21]。根據各種菌株在直立黃芪各組織部位的分離數量，計算分離率。

1.2.3 真菌中苦馬豆素的提取與檢測

1.2.3.1 真菌的富集培養與菌絲中苦馬豆素的提取：將分離到的真菌菌株分別接種于PDA培養基上，20 ℃富集培養30 d，收集菌絲0.5～1.0 g，65 ℃ 烘箱烘至恒重。然后將其研磨成粉末，置索式提取器中，70 ℃甲醇提取16 h。將甲醇提取液旋轉蒸發儀濃縮揮干，殘渣用甲醇溶解，經0.22 μm濾膜過濾后，用甲醇定容至5 mL，制成待檢液備用。直立黃芪植物組織經陰干粉碎后也按照上述方法處理，制成待檢液。

1.2.3.2 α-甘露糖苷酶抑制法測定苦馬豆素：參照張蕾蕾等[22]的方法，對各菌株菌絲和直立黃芪植物待檢液中的苦馬豆素進行定性和定量測定。若待檢液對α-甘露糖苷酶具有一定的抑制作用，則表明對應的樣品中可能含有苦馬豆素，將各樣品對ɑ-甘露糖苷酶的抑制率代入標準曲線方程計算出SW在待檢樣品中含量，每個標品或樣品進行三個重復。

1.2.3.3 超高效液相色譜-串聯質譜分析(UPLC-MS)：稱取SW標準品，配制成580、290、116、58、29 ng·mL-1的標準品水溶液。將“1.2.3.1”中的待檢液用50 ℃氮氣吹干，5 mL超純水溶解并定容，用0.22 μm混合相濾膜過濾于2 mL樣品瓶中，制成液相色譜-串聯質譜分析待檢液。將標準品和樣品分別進行超高效液相色譜-串聯質譜分析。

色譜條件：Waters Acquity UPLC BEH(2.1 mm×50 mm，粒徑1.7 μm)色譜柱，柱溫40 ℃， 進樣量1 μL，流速0.3 mL·min-1，流動相為體積分數100%的甲醇∶20 mmol·L-1醋酸銨水溶液=5∶95。

質譜條件：離子源為ESCI。毛細管電壓2.0 kV，離子源溫度150 ℃，脫溶劑氣溫度400 ℃，霧化氣800 L·Hr-1；質譜運行模式為全掃描，掃描范圍為70～300 amu， 監測離子對為174.2>156.1。

比較真菌、直立黃芪植物待檢樣品與苦馬豆素標準品液相色譜圖和質譜圖，經液相色譜分離后若樣品溶液與苦馬豆素標準品中有色譜峰保留時間相同的色譜峰，且該色譜峰對應的質譜圖的特征性離子碎片相匹配時，可確定待檢樣品中含有苦馬豆素。以SW的質量濃度(ng·mL-1)為橫坐標(x)，以標準樣品中SW色譜峰峰面積為縱坐標(y)，繪制標準曲線。將樣品測得的SW色譜峰面積代入標準曲線方程，計算出樣品中SW的含量。

1.2.4 產SW真菌的系統發育分析

1.2.4.1 產SW真菌ITS、GPD、KS序列的擴增與測序：刮取PDA培養基上的真菌菌絲0.5～1 g放入離心管中并置于冰上，玻璃鉆頭研磨菌絲至粉末，按照DNA提取試劑盒步驟提取真菌基因組DNA。分別采用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和TIS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，GPD1(5′-CAACGGCTTCGGTCGCATTG-3′)和GPD2(5′-GCCAAGCAGTTGGTTGTGC-3′)，KS-F (5′-GAGGAAATTGCTATAGTTTCCATGGC-3′)和KS-R(5′-GGCATCCGAAAGACGTTTAAGAAG-3′)擴增真菌的ITS、GPD、KS序列。PCR反應體系均為25 μL：DNA聚合酶0.25 μL，PCR緩沖液2.5 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物各1 μL，真菌DNA 0.25 μL，加雙蒸水補至25 μL。PCR反應條件：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，30個循環；最后72 ℃再延伸10 min。 PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，切取含有目的片段凝膠并用凝膠回收試劑盒進行回收，將純化回收的PCR產物送上海生工生物技術公司進行正反雙向測序，將正反測序結果比對拼接并去除引物序列，得到真菌ITS、GPD和KS序列。

1.2.4.2 產SW真菌遺傳進化樹的構建：登錄http//:www.ncbi.nlm.nih.gov數據庫，在BLAST程序中分別提交真菌的ITS、GPD和KS序列，與GenBank中的序列進行一致性比較。下載一致性較高的序列和臨近屬真菌的ITS和GPD序列信息，并用MEGA 6.0軟件中的Clustal W程序進行排列比對，采用鄰接法(Neighbor-joining, NJ)構建系統發育樹，可信度分析為1 000次。

2 結 果

2.1 分離的真菌

本研究從直立黃芪的葉、莖、根、種子中共分離到43株真菌(表1)，其中25株真菌能夠在PDA培養基上恒溫培養產生分生孢子和分生孢子梗等結構，根據該類真菌的形態特征，將其初步劃分到鏈格孢屬、鐮刀菌屬、青霉屬中；另有18株真菌在PDA等培養基上恒溫培養未觀察到分生孢子，其中13株真菌在菌落形態、顯微形態及生長特性等方面基本一致。這13株真菌菌落在PDA培養基上起初為白色，隨著培養時間的延長逐漸變為黃褐色或黑褐色。真菌在培養初期不產生色素(圖1a)，隨著時間的延長，菌落產生色素將培養基變為黃褐色(圖1b)。真菌在20 ℃黑暗培養條件下生長緩慢，生長率為(0.10±0.02) mm·d-1。 顯微鏡下，真菌菌絲較細，透明，具橫隔膜，不見分支，分生孢子梗具較厚橫隔膜，呈褐色，可見分支。經PCA培養基，20 ℃培養，每天紫外線照射2 h，黑暗培養22 h，連續培養兩周后可產生少量分生孢子，分生孢子呈褐色，長棍棒狀，直或稍彎曲，基底細胞近球形，2～8個暗的橫隔膜，3～4個的居多，在隔膜處有明顯的縊縮，未觀察到縱隔膜或斜隔膜(圖1c、1d)。以上特點與已報道的直立黃芪中分離的甘肅鏈格孢和瘋草中分離的鏈格孢屬波狀芽管孢組對照菌株NX-FEL001和NM-UA003較為相似。該類真菌在直立黃芪葉、莖、種子中均有分離，種子中分離率最高，為16.67%，但在根中未見分離，在本研究中直立黃芪根中分離的真菌主要為鐮刀菌屬真菌。

表1 直立黃芪各組織中分離的真菌種類及其分離率

a. 產苦馬豆素真菌在PDA培養基上培養7 d長出的菌落；b.產苦馬豆素真菌在PDA培養基上生長30 d的菌落；c～d.產苦馬豆素真菌的分生孢子梗和分生孢子，標尺=4 μma.The fungal colonies cultured for 7 days; b. The fungal colonies cultured for 30 days; c-d. The fungal Mycelia, conidiophores and conidia, scale= 4 μm圖1 直立黃芪中分離的產苦馬豆素真菌Fig.1 Swainsonine-producing fungal isolate from Astragalus adsurgens Pall

2.2 真菌中苦馬豆素的分析

2.2.1 α-甘露糖苷酶抑制試驗測定 以α-甘露糖苷酶抑制率y對苦馬豆素質量濃度x得標準曲線方程y=0.813 9x-1.173 8(R2=0.998)，α-甘露糖苷酶抑制試驗結果表明(表2)，當苦馬豆素濃度在0.072～18.400 μg·mL-1范圍內時，苦馬豆素的濃度與其對α-甘露糖苷酶抑制率呈現良好的線性關系。本研究應用α-甘露糖苷酶抑制法對分離的43株真菌的待檢液進行了分析，其中只有與甘肅鏈格孢相似的13株真菌可對α-甘露糖苷酶產生不同程度的抑制作用(表3)。在本研究，直立黃芪植物樣品待檢液未對α-甘露糖苷酶產生抑制作用。α-甘露糖苷酶抑制法測得菌株EA菌絲中苦馬豆素含量為(0.004±0.000)mg·g-1，對照菌株AlternariaSectionUndifilumOxytropisNX-FEL001和AlternariaSectionUndifilumOxytropisNM-UA003的苦馬豆素含量分別為(0.276±0.012)、(0.800±0.099) mg·g-1。

2.2.2 超高效液相色譜-串聯質譜分析 超高效液相色譜-串聯質譜分析結果表明，苦馬豆素標準品的色譜保留時間為(0.68±0.01)min(圖2a)，離子碎片全掃描質譜分析出現了苦馬豆素特征離子碎片MH+=(174.00±0.75) amu，該特征離子碎片經二級質譜掃描后，出現了苦馬豆素特征性二級質譜粒子碎片MH+=(156.10±0.75)amu(圖2c)。本研究中分離的EA菌株提取物經色譜分析后，在0.68 min出現與苦馬豆素標準品色譜保留時間相同的色譜峰(圖2b)，且該色譜峰對應的二級質譜離子碎片質譜圖中有苦馬豆素的特征性離子碎片(圖2d)。

以各標準品溶液的質量濃度為橫坐標(ng·mL-1)， 峰面積為縱坐標，獲得標準曲線方程為y=468.937x+4 605.51，(R2=0.997 9)，表明當苦馬豆素質量濃度在29～580 ng·mL-1時，苦馬豆素的質量濃度與苦馬豆素色譜峰峰面積呈良好的線性關系。根據標準曲線方程和樣品溶液測得的峰面積計算得出，產苦馬豆素EA菌株菌絲中苦馬豆素的含量為(0.005±0.046)mg·g-1，對照菌株AlternariaSectionUndifilumOxytropisNX-FEL001和AlternariaSectionUndifilumOxytropisNM-UA003的苦馬豆素含量分別為(0.837±0.014)、(1.123±0.032)mg·g-1。但本研究在直立黃芪植物樣品中未檢出苦馬豆素。

表2 不同濃度苦馬豆素標準品對α-甘露糖苷酶的抑制率

表3 各樣品對α-甘露糖苷酶抑制率和測定的樣品提取液中SW濃度

a. 苦馬豆素標準品液相色譜圖，苦馬豆素的色譜保留時間為0.68 min； b. EA菌株提取物液相色譜圖； c.苦馬豆素標準品色譜保留時間為0.68 min時的MH+=174離子碎片二級質譜圖； d.菌株EA提取物色譜保留時間為0.68 min時的MH+=174離子碎片二級質譜圖a. The UPLC-MS/MS chromatogram of swainsonine standard，the retention time of matrine was 0.68 min; b. UPLC-MS/MS chromatogram of the extract of EA isolate; c. MS/MS production spectrum of swainsonine (MH+=174) at 0.68 min; d. MS/MS production spectrum of the extract of EA isolate at 0.68 min圖2 苦馬豆素標準品和產苦馬豆素菌株EA提取液超高效液相色譜-串聯質譜圖Fig.2 The UPLC-MS/MS spectrometry of swainsonine standard and the extract of swainsonine-producing EA isolate

2.3 產SW真菌ITS、GPD、KS序列一致性比較

本研究分離的產苦馬豆素菌株ITS、GPD和KS基因經核苷酸序列測定，其ITS、GPD和KS基因序列長度分別為565、581、691 bp，將其序列提交GenBank，獲得的GenBank序列號分別為MG832574、MG832573、MG832575。ITS序列BLAST比對結果表明，與已報道的從直立黃芪中分離的Embellisiaastragali=Alternariagansuense(KM457057)序列一致性為100%，與瘋草中分離的鏈格孢屬波狀芽管孢組內生真菌的序列一致性高達99%～100%。GPD序列BLAST比對結果顯示，本研究分離的產苦馬豆素菌株與已報道的產苦馬豆素內生真菌AlternariaSectionU.oxytropisNX-FEL001(KF114857)、AlternariaSectionU.cinereum2DBL2010(JN632556)、AlternariaSectionU.oxytropisDAOM 237696(FJ357306)、Embellisiaastragali=Alternariagansuense(KM457057)的一致性均高達100%。KS序列BLAST比對結果顯示，本研究分離的產苦馬豆素菌株與已報道的產苦馬豆素瘋草內生真菌AlternariaSectionU.oxytropis(KY365741)的KS基因序列一致性為98%，12個位點發生了突變，其中9個位點發生了T-C堿基轉換突變，3個位點發生了堿基顛換突變。136、179、353、372 nt位點的突變導致了翻譯產物4個位點氨基酸的突變。

2.4 真菌的遺傳進化分析

由基于ITS序列構建的NJ系統發育樹(圖3)可知，本研究分離的產苦馬豆素菌株與鏈格孢屬波狀芽管孢組真菌(AlternariaSectionUndifilumsp.)聚為同一群落，其自檢支持率為99%，與Embellisiaastragali=Alternariagansuense(KM457057)處于同一分支上，自檢支持率達到86%，表明本研究分離的產苦馬豆素菌株與鏈格孢屬波狀芽管孢組真菌和Embellisiaastragali=Alternariagansuense(KM457057)遺傳進化距離最近。由基于GPD序列構建的NJ系統發育樹(圖4)可知，本研究分離的產苦馬豆素菌株與U.fulvumDBL2011(JN236556)、UndifilumbornmuelleriDAOM231361(FJ357305)、Embellisiaastragali=Alternariagansuense(KM457057)等處于同一分支，表明該類菌株與鏈格孢屬波狀芽管孢組真菌和Embellisiaastragali=Alternariagansuense(KM457057)的親緣關系最為密切。

3 討 論

本研究從直立黃芪葉、莖、根、種子中共分離到43株真菌，其中25株不經誘導即可產孢真菌分屬于鏈格孢屬、鐮刀菌屬、青霉屬等。18株真菌在PDA培養基上恒溫培養不產生分生孢子，其中13株真菌經誘導培養后可產生分生孢子，在菌落形態、顯微形態及生長特性方面與已報道的甘肅鏈格孢相似。α-甘露糖苷酶抑制法和超高效液相色譜-串聯質譜分析結果表明，該13株真菌中均含有苦馬豆素，其含量為0.004～0.005 mg·g-1。通過對該13株真菌ITS、GPD和KS基因的序列一致性比較和遺傳進化分析，進一步確定該類真菌與已報道的直立黃芪病原真菌甘肅鏈格孢(Alternariagansuense)和產苦馬豆素瘋草內生真菌(AlternariaSectionUndifilumsp.)遺傳關系最為密切。故本研究將分離到的產SW內生真菌劃分到鏈格孢屬波狀芽管孢組真菌，將其命名為甘肅波狀芽管孢(AlternariaSectionUndifilumgansuense)。本研究中甘肅波狀芽管孢的總分離率為9.03%，在葉、莖、種子中均有分布，種子中的分離率最高，但在根部未分離到該真菌。甘肅波狀芽管孢在直立黃芪中分離特征與瘋草內生真菌相似，在葉、莖、種子中均有分布，但其分離率顯著低于瘋草內生真菌[17]。要搞清楚甘肅波狀芽管孢在直立黃芪中的分布情況，還需要對不同生境、馴化和野生型直立黃芪內生真菌進行系統研究。

本研究中分離自直立黃芪的甘肅波狀芽管孢只含有少量苦馬豆素，遠遠低于兩株瘋草內生真菌對照菌株中苦馬豆素的含量。據Braun等[11]報道，美國瘋草內生真菌中苦馬豆素含量在0.471～18 mg·g-1，也遠遠高于甘肅波狀芽管孢。真菌中苦馬豆素的產生受到多種因素的影響，據Oldrup等[23]報道，低pH(4.5)或高濃度PEG可使鏈格孢屬波狀芽管孢組真菌的SW產量顯著提高。另有研究表明，L-哌可酸、L-賴氨酸、α-酮戊二酸等底物及其在培養基中的濃度可對鏈格孢屬波狀芽管孢組真菌的苦馬豆素合成產生顯著影響[22]。酵母氨酸氧化酶基因、KS基因在鏈格孢屬波狀芽管孢組真菌的苦馬豆素合成中具有重要的調控作用[15-16]。在本研究中，EA菌株的KS基因序列與瘋草內生真菌AlternariaSectionU.oxytropis(KY365741)的KS

比例尺代表堿基替換數；分支處數字代表分類單位聚集在一起的概率(Bootstrap>50%)；括號中的序號為各菌株ITS序列在GenBank中的登錄號Horizontal branch represent the expected number of substitution. The numbers of nodes represent the percentages (Bootstrap>50%) of the taxa to the right are placed together by the program. The serial numbers in the brackets are GenBank accession numbers of the ITS sequences of isolates圖3 基于ITS序列構建的NJ系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed with the program Neighbor-joining (NJ) based on ITS sequences

基因序列一致性為98%，具有高度的同源性，該結果表明，甘肅波狀芽管孢中苦馬豆素的合成可能也受KS基因的調控。甘肅波狀芽管孢與瘋草內生真菌遺傳進化關系緊密，但其苦馬豆素合成能力較低，通過比較甘肅波狀芽管孢與瘋草內生真菌的相關基因表達水平，將為進一步篩選真菌合成苦馬豆素相關基因，闡明苦馬豆素在真菌中的合成機制提供重要途徑。

本研究在直立黃芪植物組織中未檢出苦馬豆素。據Gardner等[24]的報道，在色譜-質譜聯用分析中，苦馬豆素的檢測限為0.001%，即當樣品中苦馬豆素含量較低時，樣品中的苦馬豆素可能將無法檢出。本研究結果表明，從甘肅環縣和天祝藏族自治州采集的直立黃芪植物樣品中可能不含苦馬豆素或所含的苦馬豆素質量分數低于0.001%。關于瘋草中苦馬豆素的含量及其與瘋草內生真菌關系研究表明，瘋草中普遍存在能產生SW的鏈格孢屬波狀芽管孢組內生真菌，SW在瘋草不同組織部位、不同品種或不同群落、同一群落的不同植株間含量的差異與該類真菌在瘋草中的生物量和真菌產SW能力緊密相關[25-26]。Cook等[13,27-28]的研究也表明，SW含量較低的瘋草中其內生真菌的分離率也較低，有的植物中能檢測到產SW真菌卻檢測不到苦馬豆素；本研究從直立黃芪中分離的產SW真菌同屬于鏈格孢屬波狀芽管蠕孢組，但其苦馬豆素合成量顯著低于從瘋草中分離的產苦馬豆素內生真菌。而且該真菌在直立黃芪中的分離率也顯著低于已報道的瘋草內生真菌在瘋草中的分離率。苦馬豆素在直立黃芪中的含量可能與甘肅波狀芽管孢在宿主植物中的分布和真菌苦馬豆素合成能力相關。自20世紀60年代以來，我國開始廣泛人工種植直立黃芪。本研究所采集的直立黃芪為人工栽培品種，經過長期的人工選育，其內部的真菌種類可能與野生型直立黃芪存在較大差異。野生型直立黃芪中的真菌種類及其分布情況是否與瘋草相似，是否也含有苦馬豆素，是否存在導致動物中毒的風險，因此，需要進一步對不同生境的直立黃芪中的苦馬豆素、甘肅波狀芽管孢真菌及其分布規律進行系統研究，為直立黃芪的安全利用提供重要依據。

比例尺代表堿基替換數；分支處數字代表分類單位聚集在一起的概率(Bootstrap>50%)；括號中的序號為各菌株GPD序列在GenBank中的登錄號Horizontal branch represent the expected number of substitution. The numbers of nodes represent the percentages (Bootstrap>50%) of the taxa to the right are placed together by the program. The serial numbers in the brackets are GenBank accession numbers of the GPD sequences of isolates圖4 基于GPD序列構建的NJ系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed with the program Neighbor-joining (NJ) based on GPD sequences

4 結 論

從直立黃芪中共分離到43株真菌，其中有13株菌絲中含有苦馬豆素，序列一致性和系統發育分析結果表明，該類真菌與已報道的直立黃芪病原真菌甘肅鏈格孢(Alternariagansuense)和產苦馬豆素瘋草內生真菌(AlternariaSectionUndifilumsp.)的親緣關系最近。直立黃芪中存在能產生苦馬豆素的真菌，根據形態特點和遺傳進化分析結果，作者將從直立黃芪中分離的產苦馬豆素真菌劃分到鏈格孢屬波狀芽管孢組中，并命名為甘肅波狀芽管孢(AlternariaSectionUndifilumgansuense)。