體外siRNA-GAS5干擾肝癌HepG2細(xì)胞生物學(xué)行為改變

黃海鋒，葛勇勝，劉文斌，馬金良

肝癌以病死率高[1]、生存周期短、復(fù)發(fā)率高為顯著特征，手術(shù)治療的局限性造成治療效果較差，因而手術(shù)之外新的治療方法對(duì)提高患者生存率具有重要意義。全基因組測(cè)序分析表明多數(shù)基因被轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA(non-coning RNAs,ncRNAs)，主要包括微小RNA(microRNAs)和長(zhǎng)的非編碼RNA(long non-coning RNAs, lncRNAs)[2]。lncRNAs是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA，多數(shù)lncRNAs的轉(zhuǎn)錄高度保守，在細(xì)胞內(nèi)受到嚴(yán)格的調(diào)控。lncRNAs在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲等生物學(xué)過程中具有明確的調(diào)節(jié)作用。lncRNA GAS5(growth arrest-specific transcript 5，GAS5)是由mTOR通路控制穩(wěn)定翻譯的5’-TOP RNA，在人T淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)停滯中起重要作用的非編碼RNA[3],最先從nih3t3型老鼠的纖維母細(xì)胞中分離而來[4]。GAS5在包括結(jié)直腸癌[5]、乳腺癌[6]、宮頸癌[7]、非小細(xì)胞肺癌[8-9]、胰腺癌、前列腺癌[10-11]等多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)預(yù)示較差的生存周期[6,9,12]，但不同腫瘤GAS5的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制具有明顯差異，在前列腺癌中通過靶向控制P27Kip1作用調(diào)控細(xì)胞增殖[13]，在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中通過激活BRCA1和p53來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡[14]，在結(jié)直腸癌中作為腫瘤抑制因子抑制白介素-10和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)來影響細(xì)胞增殖和遷移[5]。在肝癌方面，其表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究甚少。該研究通過檢測(cè)GAS5表達(dá)水平變化以及在細(xì)胞周期調(diào)控中具有重要作用的相關(guān)蛋白檢測(cè)，來分析其對(duì)肝癌細(xì)胞系增殖、遷移、侵襲作用，并進(jìn)一步推測(cè)其可能調(diào)控的靶點(diǎn)，為肝癌的靶向治療尋求新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1病理標(biāo)本及主要實(shí)驗(yàn)試劑收集安徽省立醫(yī)院肝臟外科2016年6月～12月肝癌組織及對(duì)應(yīng)遠(yuǎn)癌旁組織(距癌組織邊緣>2 cm)共20例，術(shù)后病理均為肝細(xì)胞性肝癌，病理標(biāo)本取下直接保存于-80 ℃的液氮中保存?zhèn)溆谩＝M織研究用途均告知家屬并予以簽署同意書。TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Life technogies 公司；DNA標(biāo)記試劑盒QuantiNova SyBr Green PCR Kit購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司 ；反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司;細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶6(cell division protein kinase 6，CDK6)一抗購(gòu)自美國(guó)Bioss公司；細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)一抗及細(xì)胞增殖檢驗(yàn)CCK-8試劑盒(cell counting Kit-8,CCK-8)購(gòu)自美國(guó)bio-teche公司；細(xì)胞因子E2F-1一抗購(gòu)自上海瑞齊實(shí)業(yè)科技有限公司；肝癌HepG2細(xì)胞株購(gòu)自上海細(xì)胞庫。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1組織RNA提取及qRT-PCR 組織RNA經(jīng)TRIzol試劑溶解提取，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備成cDNA，以β-actin作為內(nèi)參，人β-actin擴(kuò)增子的大小為180 bp，正向引物：5’-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3’，反向引物：5’-CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG -3’；人 GAS-5擴(kuò)增子大小為115 bp，正向引物：5’-CACAACAAGCAAGCATGCAG-3’，反向引物：5’-GAGGATCACTTGAGCCCAGA-3’。反應(yīng)條件：95 ℃、2 min，95 ℃、5 s，60 ℃、10 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt比較分析基因表達(dá)。

1.2.2GAS5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) NCBI上查找GAS5的序列，根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)合成一條具有GAS5的干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)組(siRNA-GAS5組)及一條對(duì)照siRNA組(siRNA-NC組)，同時(shí)設(shè)置空轉(zhuǎn)染組(Con組)， siRNA-GAS5轉(zhuǎn)染前1天，將2×105個(gè)/ml細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，每孔中加入約500 μl無抗生素的培養(yǎng)基。取1 μl/孔lipo2000，用50 μl opti-MEM無血清培養(yǎng)基稀釋，并室溫孵育5 min。取2 μl siRNA，以50 μl opti-MEM無血清培養(yǎng)基稀釋，混勻。兩種液體輕輕混勻，室溫靜置20 min。加入含有細(xì)胞及培養(yǎng)液的孔中，混勻。轉(zhuǎn)染6 h后，換為含血清的完全培養(yǎng)基。細(xì)胞收集后PCR檢測(cè)確認(rèn)GAS5表達(dá)下降后，細(xì)胞予以備用。

1.2.3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)周期細(xì)胞，以2×105個(gè)/ml、每孔接種2 ml細(xì)胞液，過夜，愈合度100%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，開始劃線。劃線與板底橫線交叉點(diǎn)即為固定觀察點(diǎn)；劃痕后按0、48 h時(shí)間點(diǎn)拍照。測(cè)定各組細(xì)胞在0、48 h觀察點(diǎn)的劃痕寬度，計(jì)算遷移率(%)=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.4Transwell實(shí)驗(yàn) Matrigel膠與DMEM培養(yǎng)基按1 ∶9混勻制成稀釋液。小室濾膜均勻涂抹50 μl稀釋液，37 ℃、5% CO2恒溫箱滯留2 h,取出涂抹DMEM培養(yǎng)基50 μl 恒溫箱滯留2 h。取3組培養(yǎng)24 h細(xì)胞，0.25%胰酶消化，1 000 r/min離心 5 min， DMEM 培養(yǎng)液得下層細(xì)胞，計(jì)數(shù)，細(xì)胞密度調(diào)為1×106個(gè)/ml。上室加下層細(xì)胞液各200 μl，下室加600 μl 30% FBS的DMEM培養(yǎng)液，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔。取出小室，上室培養(yǎng)液吸除，PBS浸潤(rùn)2 min，共3次，擦凈上室表面Martrigel膠，95%酒精固定30 min，結(jié)晶紫染色15 min，晾干。拍照、計(jì)數(shù)：200倍顯微鏡下計(jì)算出穿膜細(xì)胞均數(shù)。

1.2.5CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 待檢測(cè)細(xì)胞計(jì)數(shù)，并度鋪于96孔板。確定細(xì)胞貼壁后，繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h使其貼壁緊密。WST-8混合液儲(chǔ)存液用PIPES緩沖液稀釋10倍到使用濃度。96孔板每個(gè)孔加入10 μl CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育0.5～4 h。顯色反應(yīng)后，加入終止液10 μl，終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450 nm測(cè)定吸光度，每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔實(shí)驗(yàn)。根據(jù)OD450值繪制0、24、48、72、96 h增殖曲線。

1.2.6Western blot檢測(cè) 組織樣品稱重100 mg，加入RIPA細(xì)胞裂解液1 ml(內(nèi)含1 mmol/L PMSF),提取組織總蛋白。蛋白按照1 ∶4加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min變性，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，一抗、二抗孵育，使用ECL超敏發(fā)光試劑盒來檢測(cè)蛋白。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方案同組織實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1GAS5、CDK6在肝癌組織、癌旁組織表達(dá)情況20對(duì)肝癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)GAS5和CDK6在肝癌和癌旁組織中均出現(xiàn)表達(dá)，qRT-PCR結(jié)果表明GAS5在肝癌組織相對(duì)表達(dá)量(0.49±0.47)低于癌旁組織(1.12±0.53),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.22,P<0.01)，見圖1，CDK6在80%(16/20)的肝癌組織出現(xiàn)高表達(dá)，表達(dá)明顯高于癌旁組織(圖2)。

圖1 GAS5在癌組織與癌旁組織相對(duì)表達(dá)量對(duì)比

圖2 Western blot檢測(cè)20組肝癌組織與癌旁組織CDK6表達(dá)情況

2.2GAS5對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲、遷移、增殖影響與轉(zhuǎn)染siRNA-GAS5組(60.0±5.00)比較，siRNA-NC組(29.66±5.03)和Con組(28.33±9.07)的HepG2細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明遷移能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.76，P<0.01)；Con組與siRNA-NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (圖3)。Transwell實(shí)驗(yàn)表明，與siRNA-NC組(38.7±5.69)和Con組(32.0±10.1)比較, 轉(zhuǎn)染siRNA-GAS5組(61.57±7.60)HepG2細(xì)胞形態(tài)差異大，穿過Martrigel膠細(xì)胞數(shù)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.80，P<0.05), 而siRNA-NC組與Con組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。CCK-8檢測(cè)干擾后的細(xì)胞在450 nm OD值表明，隨時(shí)間變化均出現(xiàn)吸光度增長(zhǎng)趨勢(shì)，在96 h測(cè)量結(jié)果顯示，與siRNA-GAS5組(0.76±0.07)比較，siRNA-NC組(0.54±0.02)和Con組(0.56±0.03)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.21，P<0.01)，siRNA-NC組和Con組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。

圖3 經(jīng)siRNA干擾后HepG2細(xì)胞遷移率比較

A：siRNA-GAS5組；B：siRNA-NC組；C：Con組；1:0 h；2:48 h；與siRNA-NC組比較：**P<0.01；與Con組比較：##P<0.01

圖4 經(jīng)siRNA的HepG2細(xì)胞侵襲性比較 ×200

A：siRNA-GAS5組24 h侵襲圖；B：siRNA-NC組24 h侵襲圖；C：Con組24 h侵襲圖；與siRNA-GAS5組比較：*P<0.05；與Con組比較：#P<0.05

圖5 轉(zhuǎn)染siRNA后HepG2細(xì)胞OD450值比較

2.3經(jīng)siRNA-GAS5轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)影響經(jīng)siRNA-GAS5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞內(nèi)Cyclin D1、CDK6、E2F-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均出現(xiàn)上調(diào)，與siRNA-NC組和Con組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1、圖6。

2.4GAS5的下調(diào)對(duì)HepG2細(xì)胞周期變化影響經(jīng)GAS5-siRNA干擾48 h后的G1、S、G2期細(xì)胞百分比變化(39.73±3.21、43.03±4.72、16.25±8.69vs50.51±4.98、35.40±5.28、17.10±4.25)。由各細(xì)胞百分比變化可知，與siRNA-NC組比較，siRNA-GAS5組細(xì)胞周期在G1期出現(xiàn)降低，S期出現(xiàn)升高，siRNA-GAS5組與siRNA-NC組在G1期與S期發(fā)生明顯轉(zhuǎn)變(圖7)。

表1 轉(zhuǎn)染siRNA及空白組相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)量

與siRNA-NC組比較：**P<0.01；與Con組比較：##P<0.01

圖6 siRNA干擾后的HepG2細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)及相應(yīng)mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

A: Western blot檢測(cè)CDK6、Cyclin D1、E2F-1 蛋白表達(dá); B: CDK6 mRNA相對(duì)表達(dá)量; C: Cyclin D1 mRNA相對(duì)表達(dá)量; D: E2F-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量;1：siRNA-NC組；2：Con組；3：siRNA-GAS5組；與siRNA-NC組比較：**P<0.01；與Con組比較：##P<0.01

圖7 GAS5參與細(xì)胞周期調(diào)控

A：流式細(xì)胞儀檢測(cè)siRNA-NC轉(zhuǎn)染的周期計(jì)數(shù)圖；B：流式細(xì)胞儀檢測(cè)siRNA-GAS5轉(zhuǎn)染的周期計(jì)數(shù)圖；C：siRNA-GAS5和siRNA-NC轉(zhuǎn)染后GAS5相對(duì)表達(dá)量；D：經(jīng)siRNA-GAS5與siRNA-NC轉(zhuǎn)染48 h各周期細(xì)胞百分比；與siRNA-GAS5組比較：**P<0.01

3 討論

近年來，已發(fā)現(xiàn)多種lncRNAs在細(xì)胞功能調(diào)節(jié)上具有重要作用，研究[6]表明GAS5具有抑制小膠質(zhì)細(xì)胞M2的極化以及加劇了脫髓鞘作用。GAS5調(diào)控TGF-β介導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞分化通過結(jié)合RNA-smad實(shí)現(xiàn)[11]；GAS5是一個(gè)參與細(xì)胞生物調(diào)控的lncRNA,通過與E2F1相互作用和引誘其與P27Kip1啟動(dòng)子結(jié)合來抑制前列腺癌增殖[15]。其主要在腫瘤抑制和致癌基因表達(dá)調(diào)控方面發(fā)揮作用，這些實(shí)例充分說明GAS5可作為腫瘤進(jìn)展過程中重要的功能性調(diào)控因子，其異常表達(dá)參與腫瘤相關(guān)蛋白差異性表達(dá)促使腫瘤發(fā)生。

多數(shù)腫瘤發(fā)生發(fā)展是因GAS5在癌組織中出現(xiàn)下調(diào)所致，例如乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌等。本研究首先對(duì)肝癌組織與其對(duì)應(yīng)的癌旁組織PCR檢測(cè)結(jié)果顯示GAS5表達(dá)下降，前期實(shí)驗(yàn)選取肝癌表型中常見的HepG2細(xì)胞，經(jīng)PCR檢測(cè)顯示其GAS5表達(dá)量較正常肝細(xì)胞明顯下調(diào)，為探討GAS5對(duì)HepG2細(xì)胞增殖遷移能力及其對(duì)HepG2細(xì)胞周期影響作用，本研究對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行siRNA-GAS5干擾實(shí)驗(yàn)，PCR檢測(cè)干擾后HepG2出現(xiàn)GAS5明顯下調(diào)的細(xì)胞再分別進(jìn)行細(xì)胞劃痕遷移實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)以及CCK-8檢測(cè)干擾后細(xì)胞增殖OD值，實(shí)驗(yàn)顯示經(jīng)GAS5-siRNA干擾的HepG2細(xì)胞株較siRNA-NC組、Con組的HepG2細(xì)胞，其細(xì)胞的遷移能力、侵襲能力、增殖能力都出現(xiàn)增強(qiáng)，對(duì)于siRNA-NC與未經(jīng)siRNA干擾的HepG2相比，其三者能力為出現(xiàn)明顯改變。說明GAS5在肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性方面具有重要的抑制腫瘤增殖侵襲作用。GAS5可作為一個(gè)腫瘤抑癌因子抑制肝癌細(xì)胞體外侵襲轉(zhuǎn)移。

在細(xì)胞周期的調(diào)控中GAS5同樣具有明顯的抑制或促進(jìn)凋亡作用。體外對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖研究中表明，上調(diào)的GAS5抑制細(xì)胞增殖、遷移和凋亡是通過降低細(xì)胞內(nèi)miR-196a和miR-205水平[10]；此外GAS5的表達(dá)同樣在前列腺癌中出現(xiàn)低表達(dá)，GAS5的異位表達(dá)抑制了細(xì)胞增殖和調(diào)控細(xì)胞周期停留在G0/G1期，GAS5-siRNA干擾下調(diào)GAS5時(shí)又促進(jìn)G1-S相過度。這些研究證實(shí)在腫瘤進(jìn)展期中，GAS5通過不同的調(diào)控通路調(diào)控細(xì)胞周期來抑制腫瘤細(xì)胞進(jìn)展已十分確切。本研究通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)經(jīng)GAS5-siRNA干擾下調(diào)GAS5的HepG2細(xì)胞，相對(duì)于未進(jìn)行轉(zhuǎn)染和siRNA-NC轉(zhuǎn)染組的HepG2細(xì)胞來說，其細(xì)胞周期發(fā)生明顯改變，處于 G0/G1期細(xì)胞減少，而S期細(xì)胞明顯增多，證實(shí)在肝癌細(xì)胞內(nèi)的GAS5的水平含量與細(xì)胞周期改變相關(guān)，這和宮頸癌、前列腺癌的細(xì)胞周期研究得到相似的結(jié)果，但不同細(xì)胞內(nèi)因其細(xì)胞分化方向不同，細(xì)胞生物特性有所差異，其表達(dá)的功能性蛋白不同，GAS5在不同細(xì)胞內(nèi)對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制也不盡不同。

研究[15]表明與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)的Ras下游通路的周期蛋白依賴性激酶系統(tǒng)、Cyclin D蛋白家族與消化系統(tǒng)中的胃癌和胰腺癌有密切的關(guān)系。通過CDK6和Cyclin D1以及其下游調(diào)控的E2F-1研究，推斷GAS5參與細(xì)胞周期調(diào)控的潛在機(jī)制。Western blot檢測(cè)肝癌和癌旁組織表明CDK6與GAS5表達(dá)水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系,二者間可能存在潛在的直接或間接調(diào)控關(guān)系，進(jìn)一步對(duì)經(jīng)siRNA-GAS5轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞Cyclin D1、CDK6、E2F-1蛋白進(jìn)行Western blot與PCR檢測(cè)，低表達(dá)GAS5的HepG2細(xì)胞中Cyclin D1、CDK6 、E2F-1均出現(xiàn)表達(dá)水平的上升， 細(xì)胞內(nèi)Cyclin D1蛋白出現(xiàn)異常表達(dá)，可能和GAS5通過Ras-MAPK途徑來激活Cyclin D1基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)，E2F-1蛋白水平上調(diào)證實(shí)GAS5同樣參與HepG2細(xì)胞細(xì)胞周期調(diào)控，這與Shan et al[15]研究相符。MTT結(jié)果驗(yàn)證GAS5對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控主要在G1/S期轉(zhuǎn)變，這與細(xì)胞內(nèi)Cyclin D1通過與CDK6形成復(fù)合物激活底物pRb的磷酸化相關(guān)，pRb的磷酸化使得與pRb結(jié)合的組蛋白脫乙酰基蛋白(HDAC)破環(huán)，生成E2F-1明顯增加,E2F-1是細(xì)胞周期進(jìn)展到S期所需細(xì)胞周期因子。HepG2細(xì)胞周期相關(guān)蛋白上調(diào)驗(yàn)證其與GAS5表達(dá)密不可分。