耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌藥物敏感性和耐藥基因研究

王 健，潘亞萍，徐元宏，沈繼錄，王中新

碳青霉烯類抗生素對(duì)大多數(shù)革蘭陽(yáng)性、陰性需氧菌、厭氧菌及多重耐藥菌均有較強(qiáng)的抗菌活性，已成為臨床對(duì)抗耐藥菌株有力的武器。2001年首次報(bào)道了一株碳青霉烯類抗生素耐藥的肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)[1],該株細(xì)菌能對(duì)包括碳青霉烯類抗生素在內(nèi)的所有β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。隨后不久，世界各地均有CRKP菌株被報(bào)道的案例出現(xiàn)[2-3]。

肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥性是目前全球性關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題[4-5]。產(chǎn)碳青霉烯酶是腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥最主要的耐藥機(jī)制，目前研究[6]肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南耐藥主要系產(chǎn)生KPC型碳青霉烯酶。該研究對(duì)臨床分離的31株CRKP的耐藥表型和耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)分析以及外排泵抑制劑對(duì)CRKP的作用進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來(lái)源 31株CRKP來(lái)源于醫(yī)院臨床分離菌，經(jīng)法國(guó)梅里埃公司Vitek2全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定，對(duì)碳青酶烯類均耐藥。

1.1.2主要儀器和試劑 GeneAmp970基因擴(kuò)增儀(美國(guó)PE公司)；C-880V CO2孵箱、蛋白電泳分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；高速冷凍離心機(jī)(中國(guó)heal force公司)；抗菌藥物(美國(guó)BBL公司、英國(guó)OXOID公司)；藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基為Muller-Hinton瓊脂；外排泵抑制劑(Phe-Arg-β-naphthylamide，PAβN)(美國(guó)Sigma公司)；標(biāo)志物DL 2 000、Ex Taq DNA聚合酶試劑盒購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；瓊脂糖、引物購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2方法

1.2.1藥敏實(shí)驗(yàn)及細(xì)菌鑒定 采用CLSI 2014版推薦的紙片擴(kuò)散法和Vitek2法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)并判讀結(jié)果，細(xì)菌鑒定采用全自動(dòng)微生物鑒定。最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)測(cè)定按CLSI2010版推薦的瓊脂稀釋法進(jìn)行。亞胺培南和美羅培南濃度范圍為128～0.06 mg/L。細(xì)菌接種菌量為104CFU/點(diǎn)。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌(ATCC 25922)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)、肺炎克雷伯菌(ATCC BAA1705/ATCC BAA1706)。

1.2.2碳青霉烯酶的篩選

1.2.2.1Carba-NP試驗(yàn) A液配制：取25～50 ml燒杯，將2 ml 0.5%酚紅溶液加入到16.6 ml純水中，加入180 ml 10 mmol/L硫酸鋅溶液，使用0.1 N氫氧化鈉溶液(或10%鹽酸溶液)調(diào)整pH值為(7.8±0.1)。B液配制：A液+6 mg/ml亞胺培南。步驟：標(biāo)記兩個(gè)微量離心管分別為a、b，每管中加入100 μl 細(xì)菌蛋白抽提液(美國(guó)Thermo Scientific公司)，1 μl接種環(huán)待測(cè)物(從過(guò)夜的血平板上刮取)，渦旋震蕩器上劇烈震蕩5 s后，a管中加入100 μl A液，b管中加入100 μl B液，渦旋振蕩混勻，35 ℃溫箱孵育2 h觀察結(jié)果(每30 min觀察一次顏色變化)。

1.2.2.2改良Hodge試驗(yàn) 按CLSI 2012推薦的方法進(jìn)行，將0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏拇竽c埃希菌ATCC25922稀釋10倍后涂布于M-H平板，中間貼厄他培南(10 μg)紙片，接種環(huán)自紙片外緣向平板邊緣劃線接種待檢菌，注意不要?jiǎng)澠破桨灞砻妗?5 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日，厄他培南抑菌圈處出現(xiàn)矢狀生長(zhǎng)者為待檢菌產(chǎn)碳青霉烯酶。

1.2.3PCR擴(kuò)增KPC、ESBL和AmpC酶基因 提取并純化細(xì)菌基因組DNA作為擴(kuò)增模板，KPC、NDM-1、ESBL和AmpC酶基因。產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下成像分析結(jié)果。擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序均由上海生工公司完成。獲得序列與GenBank中序列進(jìn)行比對(duì)，以證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物為目的基因片段和確定基因型。

1.3外排泵的抑制試驗(yàn)在采用瓊脂稀釋法測(cè)定亞胺培南單藥MIC的同時(shí)另設(shè)一組加入泵抑制劑PAβN(終濃度20 mg/L)的亞胺培南的試驗(yàn)組。亞胺培南的濃度范圍為128～0.06 mg/L。外排泵表型檢測(cè)結(jié)果的判斷以添加和不添加PAβN時(shí)MIC值降低4倍或4倍以上者可推斷認(rèn)為該菌具有外排泵機(jī)制。

1.4ERIC-PCR同源性分析引物序列：ERIC1: ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC；ERIC2：AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG。擴(kuò)增條件如下：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，2 ℃延伸1 min，共20個(gè)循環(huán)，隨后94 ℃變性1 min, 42 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳(100 V，100 min，0.5×TBE)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用WHONET 5.6軟件對(duì)紙片法的抑菌圈直徑藥敏結(jié)果和儀器法MIC藥敏結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果

2.1藥敏試驗(yàn)結(jié)果所有菌株對(duì)碳青霉烯類耐藥率為100%，對(duì)頭孢菌素類、氨基糖苷類和喹諾酮類耐藥率均高于80%，而四環(huán)素類抗生素耐藥率在20%左右，見(jiàn)圖1。

2.2碳青霉烯酶檢測(cè)結(jié)果結(jié)果顯示有29株CRKP的Carba-NP試驗(yàn)和改良Hodge試驗(yàn)均為陽(yáng)性，陽(yáng)性率93.5%，24號(hào)株Carba-NP試驗(yàn)陽(yáng)性而改良Hodge試驗(yàn)陰性，6號(hào)株Carba-NP試驗(yàn)和改良Hodge試驗(yàn)均為陰性。

2.3耐藥基因檢測(cè)結(jié)果PCR結(jié)果顯示KPC酶基因檢出率為87.1%，均為KPC-2型，NDM-1的檢出率為71.0%；ESBLs本次檢測(cè)的耐藥基因中blaCTX-M、blaSHV和blaTEM陽(yáng)性率分別為61.3%、96.8%和77.4%；質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶檢測(cè)出DHA、CTT、FOX酶基因，陽(yáng)性率分別為100%、61.3%、87.1%。未檢出SME、OXA-48、GES、VIM、IMP、VEB、AAC、EBC、MOX。

2.4外排泵的抑制試驗(yàn)結(jié)果泵抑制劑PAβN和亞胺培南、美羅培南和替加環(huán)素協(xié)同試驗(yàn)的結(jié)果顯示有3株對(duì)亞胺培南和美羅培南的MIC分別下降了4倍和8倍，而替加環(huán)素卻未下降。

2.5ERIC-PCR基因分型31株CRKP主要分為9型，其中1型13株，4型和5型各5株，6型和8型各2株，2、3、9型各1株。見(jiàn)圖2。

圖1 31株CRKP對(duì)常見(jiàn)抗生素的耐藥率和敏感率

AMP：氨芐西林；PRL：哌拉西林；SCF：頭孢哌酮/舒巴坦；SAM：氨芐西林/舒巴坦；TZP：哌拉西林/他唑巴坦；CZO：頭孢唑啉；CXM：頭孢呋辛；CAZ：頭孢他啶；CRO：頭孢曲松；CTX：頭孢噻肟；FEP：頭孢吡肟；CTT：頭孢替坦；ATM：氨曲南；IMP：亞胺培南；MEM：美羅培南；AMK：阿米卡星；GEN：慶大霉素；TOB：妥布霉素；CIP：環(huán)丙沙星；LVX：左旋氧氟沙星；SXT：復(fù)方新諾明；FOS：磷霉素；NIT：呋喃妥因；MH：米諾環(huán)素；TGC：替加環(huán)素

圖2 部分臨床菌株ERIC-PCR基因分型圖譜

M：Marker；1、2、4、6、7:1型；3：2型；5：3型；8、9、10、14:4型；11、12、13、15:5型；16:6型

3 討論

碳青霉烯類對(duì)質(zhì)粒介導(dǎo)的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)、染色體及質(zhì)粒介導(dǎo)的頭孢菌素酶(AmpC酶)均具有高度穩(wěn)定性，但可被碳青霉烯酶水解滅活，造成碳青酶烯類抗生素耐藥。隨著臨床應(yīng)用的不斷增加，產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌感染持續(xù)增多，我國(guó)克雷伯菌屬細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥率呈逐年上升趨勢(shì)，形勢(shì)不容樂(lè)觀[7]。本研究中篩選的31株CRKP，同時(shí)對(duì)青霉素類、頭孢菌素、氨曲南等其他β內(nèi)酰胺類抗菌藥物也表現(xiàn)出高度耐藥，而對(duì)四環(huán)素類耐藥率較低。數(shù)據(jù)表明本院分離的CRKP多為高水平耐藥的多重耐藥菌，而有效抗生素范圍很窄，這對(duì)本院臨床治療感染帶來(lái)嚴(yán)重挑戰(zhàn)，前景令人擔(dān)憂。

革蘭陰性菌對(duì)碳青霉烯類的耐藥機(jī)制，最突出的是碳青霉烯酶的產(chǎn)生[8]，其他的還有高產(chǎn)AmpC酶伴外膜孔蛋白的丟失、靶位點(diǎn)的改變和主動(dòng)泵出系統(tǒng)的過(guò)量表達(dá)。目前常見(jiàn)的碳青霉烯酶主要有KPC、IMP、VIM、NDM等，國(guó)內(nèi)以KPC和IMP為主[9]。Carba-NP試驗(yàn)和改良Hodge試驗(yàn)是CLSI推薦的碳青霉烯酶表型檢測(cè)方法。本研究中所有產(chǎn)KPC菌Carba-NP 試驗(yàn)和改良Hodge試驗(yàn)均陽(yáng)性，表明Carba-NP 試驗(yàn)和改良Hodge試驗(yàn)檢測(cè)KPC型碳青霉烯酶有較高的靈敏度，可用于對(duì)疑是產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌進(jìn)行表型初篩試驗(yàn)。31株CRKP有4株KPC基因檢測(cè)陰性，其中3株均攜帶NDM-1基因，NDM-1可水解碳青霉烯類抗生素，剩下的6號(hào)株Carba-NP試驗(yàn)和改良Hodge試驗(yàn)均為陰性，KPC基因和NDM-1基因檢測(cè)也陰性，而膜孔蛋白OmpK35/36均未缺失，可能由于細(xì)菌產(chǎn)ESBLs酶出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果[10]或其他耐藥機(jī)制。

本研究中KPC型碳青霉烯酶均為KPC-2型，檢出率87.1%。KPC-2酶能單獨(dú)引起碳青霉烯類耐藥，不依賴于膜孔蛋白的丟失，基因由可轉(zhuǎn)移的70 kb質(zhì)粒編碼，位于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)座子上，具有高傳播可能。2009年，英國(guó)卡迪夫大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在肺炎克雷伯桿菌中首次發(fā)現(xiàn)了一種新型金屬β-內(nèi)酰胺酶，即NDM酶，該酶可以水解除氨曲南以外的所有β-內(nèi)酰胺類藥物，包括碳青霉烯類抗生素，其最常見(jiàn)NDM-1型，在我國(guó)NDM-1檢出率逐年上升[11]。本院CRKP中NDM-1型檢出率較高，為71.0%，加大了臨床治療CRKP感染的難度，因此院感科要引起重視。我國(guó)ESBLs流行的種類以CTX型和SHV型為主[12]，本院流行耐藥基因型與國(guó)內(nèi)報(bào)道基本一致。本研究AmpC酶陽(yáng)性率為100%，主要為DHA型和FOX型。所有菌株未檢出 EBC、ACC和MOX酶基因。耐藥基因檢測(cè)結(jié)果顯示，26株菌同時(shí)攜帶KPC、ESBL、AmpC三種酶基因，說(shuō)明CRKP存在多種耐藥基因積聚共存現(xiàn)象。Ogbolu et al[13]認(rèn)為產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌往往同時(shí)攜帶其他種類抗菌藥物的耐藥基因。耐藥細(xì)菌通過(guò)產(chǎn)生多種β-內(nèi)酰胺酶基因以及質(zhì)粒水平轉(zhuǎn)移導(dǎo)致耐藥性播散及拓寬耐藥譜，可能是導(dǎo)致菌株耐藥性更強(qiáng)、耐藥譜更廣的原因。

外排泵系統(tǒng)的表達(dá)是肺炎克雷伯菌產(chǎn)生耐藥性的重要機(jī)制[14]。細(xì)菌的外排泵系統(tǒng)包括：耐藥結(jié)節(jié)化細(xì)胞分化家族、ATP結(jié)合盒家族、主要易化子超家族、小多重耐藥家族和多藥及毒性化合物外排家族。通過(guò)外排泵表型抑制試驗(yàn)，結(jié)果顯示3株細(xì)菌對(duì)亞胺培南和美羅培南的MIC分別下降了4倍和8倍，可能是外排泵機(jī)制導(dǎo)致的耐藥。Filgona et al[15]也發(fā)現(xiàn)外排泵抑制劑可以降低CRKP對(duì)厄他培南、多尼培南的MIC值。Seecoomar et al[16]研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌中ArcAB外排泵與β-內(nèi)酰胺類耐藥有關(guān)。

本研究中31株CRKP的基因分型顯示有9種類型，其中1型13株，為主要流行株，表明我院可能存在1型克隆株的播散流行，由于CRKP耐藥嚴(yán)重，易發(fā)生流行，因此要嚴(yán)格控制抗菌藥物的使用，加強(qiáng)院內(nèi)感染的防控措施。其次為4型和5型各5株，6型和8型各2株，2、3、9型各1株。

CRKP通常合并其他抗生素耐藥，發(fā)展為多重耐藥菌，有效治療藥物有限，給臨床治療帶來(lái)了極大的困擾。我院肺炎克雷伯菌產(chǎn)碳青霉烯酶為KPC-2型酶，且常常合并產(chǎn)生ESBLs酶和AmpC酶，形成耐藥基因的積聚共存現(xiàn)象，導(dǎo)致細(xì)菌的多重耐藥。外排泵的表達(dá)可能參與肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥，其關(guān)系有待進(jìn)一步研究。同時(shí)臨床應(yīng)加強(qiáng)醫(yī)院感染控制及用藥管理，避免耐亞胺培南肺炎克雷伯菌傳播擴(kuò)散。