豬繁殖與呼吸綜合征病毒對Marc145細胞自噬相關基因轉錄的影響及分析

李小璟，龔雙燕，馬海強，劉 丹，高 健，彭 雪，朱 玲，2，徐志文，2*

(1. 四川農業大學動物醫學院，成都 611130；2. 四川農業大學動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，成都 611130； 3.四川百諾吉科技有限公司，綿陽621000)

1963年，自噬研究者Christian de Duve 首次公開提出“自噬”這一概念，而后自噬這一名詞逐漸開始出現在人們的視線中。自噬(autophagy)是細胞普遍的代謝途徑之一，也是細胞自我保護機制之一，發生自噬的細胞通過溶酶體降解機制對自身細胞器和外源異物進行包裹、吞噬、降解，將細胞器、蛋白質、病原微生物等大分子物質轉化為氨基酸等小分子物質，以實現物質的循環利用和抵抗異物入侵[1]。依據被降解物運送至溶酶體方式的不同，自噬通常分為三種類型:分子伴侶自噬、微自噬、巨自噬[2]。巨自噬發生時可通過透射電鏡在細胞內發現雙層膜包裹的非細胞器結構，其中常包裹衰老變形的細胞器、蛋白質、外來異物及入侵的病原微生物等，這種雙層膜結構被稱作“自噬泡”，自噬泡是目前較為認可的自噬發生的金標準[3]。自噬相關基因統稱為ATG，以酵母自噬基因的研究為例，目前已有30個左右的酵母基因被證實參與自噬過程。不同的ATG在自噬發生時擔負不同的功能，如ATG6主要在自噬泡形成的早期發揮作用[4]，ATG1主要是對自噬的發生起激活作用[5]，ATG5與ATG12相互結合，形成聚合體[6]，促進LC3蛋白脂質化，進而促進自噬。小分子GTP酶家族成員Rab11a被證明在自噬體成熟中具有重要作用，且Rab11a被沉默后將導致胞內PRRSV NSP2和ORF7的表達受到損害[7]。已有研究表明PRRSV能激活細胞自噬，自噬被激活后PRRSV繼續阻止自噬體和溶酶體融合以維持自噬發生，并通過該方式利用自噬來增強自身復制[8-9]。就自噬基因而言，Beclin1作為比較重要的自噬基因，其在自噬發生中具有啟動意義[10]，同時也與病毒增殖關系密切[11]。自噬標記蛋白LC3Ⅱ也是自噬監測的重要指標，LC3Ⅱ蛋白水平的高低與自噬相關基因Beclin1的表達量密切相關。LC3蛋白能裂解成為LC3Ⅱ和LC3Ⅰ，這兩者均能在一定程度上反映細胞的自噬水平，但通常認為LC3Ⅱ/內參蛋白更能真實反映自噬情況[12-13]。

近年來，越來越多的研究證明細胞自噬與多種疾病的發生關系密切[14]，與病毒復制也有一定關系[15]，自噬也越來越受到研究者的重視。值得一提的是，在細胞自噬的研究上，相關蛋白的研究比較多，但對自噬相關基因的研究卻較少。Beclin1作為近年自噬研究中的明星分子，其mRNA的轉錄變化具有重要研究意義。ATG5與ATG12在自噬過程中形成復合物，對細胞自噬過程起正向調控作用，探究ATG5與ATG12基因mRNA的轉錄規律對了解自噬過程有積極意義。本研究對感染PRRSV SC株前后Marc145細胞Beclin1、ATG5和ATG12的mRNA基因的轉錄進行測定，探究PRRSV SC株對Marc145細胞自噬相關基因轉錄的影響及規律、為細胞自噬與病毒增殖相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞系與病毒

Marc145細胞系、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)SC株均由四川農業大學動物疫病與人類健康四川省重點實驗室保存。

1.2 試劑及儀器

pMD19-T Simple Vector、RNA抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒等均購自寶生物工程(大連)有限公司，SYBR Green Premix ExTaqⅡ、DL2000 DNA Marker等均為天根生化科技(北京)有限公司產品。大腸桿菌DH5α感受態細胞由本實驗室自行制備。實時熒光定量儀器CFX-96 touch購自BIO-RAD公司。

1.3 引物設計與合成

根據GenBank中登錄的Beclin1、ATG5和ATG12基因序列(登錄號NC_027908.1等)利用DNAStar軟件分析比較，選擇保守區域序列，利用引物設計軟件Primer Primer5分別設計一對特異性引物，引物序列及預期目的片段長度如表1。

1.4 熒光定量PCR方法的建立

1.4.1 反應條件優化 反應體系采用25 μL，分別對引物、標準質粒、TM值和反應程序進行優化，以熒光值、Ct值、熔解曲線為判定依據，同時設立空白對照，選擇最優的反應條件。

1.4.2 標準曲線的繪制 以梯度稀釋的標準質粒為模板，參照優化后的反應條件進行實時熒光定量PCR，以拷貝數對數為橫坐標，Ct值為縱坐標繪制標準曲線。

1.4.3 重復性、穩定性及敏感性試驗 于不同時間對梯度稀釋的標準質粒進行獨立的重復試驗，共計5次，觀察所呈現曲線的組間穩定性和重復性。抽選同一稀釋梯度下的標準質粒，設立3個重復，觀察所呈現曲線的組內穩定性和重復性。將標準質粒做10倍連續稀釋后作為模板，進行常規PCR和實時熒光定量PCR，通過熒光信號和電泳條帶判斷其敏感性。

1.5 樣品準備及熒光圖片的采集

1.5.1 孔板的制備 5%二氧化碳濃度及37 ℃細胞培養箱中培養Marc145細胞，使用含10%血清濃度的DMEM培養基，吸取細胞懸液于6孔板中，每孔2.5 mL。按相同方法共鋪6個6孔板，3個用于試驗組等待接毒，3個用作對照(為Marc145細胞)。試驗組按0.5 MOI接毒，接毒1 h后棄去孔內液體，每孔加入2.5 mL維持液。重復兩次，共計三次重復。

1.5.2 樣品的收集 Marc145細胞的收集：于傳代后的12 h第一次收集細胞，而后每隔12 h收集一次，最后一次收集為傳代后的72 h，將所收細胞凍存于超低溫冰箱備用。病毒液的收集：于接毒后的12 h第一次收集病毒液，而后每隔12 h收集一次，最后一次收集為接毒后的72 h，將所收病毒液凍存于超低溫冰箱備用。

1.5.3 核酸的準備 RNA抽提試劑盒抽提試驗組和對照組總RNA，經核酸蛋白儀測定濃度，0.1%DEPC水調定RNA濃度一定后反轉錄為cDNA，凍存于超低溫冰箱備用。

1.5.4 自噬相關基因mRNA轉錄的測定 利用本文建立的Beclin1、ATG5及ATG12實時熒光定量檢測方法分別對“1.5.3”中試驗組和對照組cDNA進行熒光定量檢測。

2 結 果

2.1 實時熒光定量方法的建立

2.1.1 反應條件的優化 優化后的反應條件：反應體系25 μL，其中上、下游引物各1 μL,質粒標準品2 μL，SYBR Green Premix ExTaqⅡ12.5 μL，ddH2O補足到25 μL；退火溫度均為56 ℃；反應采用的三步法：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，39個循環。

2.1.2 自噬相關基因標準曲線的繪制 如圖1顯示，標準品與其對應的Ct值線性關系良好，Beclin1、ATG5及ATG12相關系數R2分為0.998、0.998、0.999，斜率Slope分別為-3.485、-3.347、-3.571，y軸截距分別為34.614、33.778、34.357，所建立的標準曲線分別為y=-3.485x+34.614，y=-3.347x+33.778，y=-3.571x+34.357。

A.Beclin1；B.ATG5；C.ATG12圖1 自噬相關基因實時熒光定量PCR的標準曲線Fig.1 The standard curves of the real-time PCR of autophagy-related genes

2.2 PRRSV SC株一步生長曲線的繪制及自噬相關基因mRNA轉錄量的檢測

2.2.1 PRRSV SC株一步生長曲線的繪制 PRRSV SC 株熒光定量檢測方法由本實驗室自行建立[16]。利用所建方法分別對0、4、8、12、24、36、60、84 h的病毒含量進行測定，繪制PRRSV SC 株一步生長曲線(圖2)：8 h前PRRSV增殖緩慢，8～24 h病毒進入對數增殖期，在24～60 h達到平穩期，60～84 h病毒增殖快速下降。PRRSV感染Marc145細胞后，由于細胞量相對充足，病毒在8～24 h快速增殖，60 h后由于細胞大量病變、營養物質缺乏，病毒增殖速度明顯降低。

圖2 PRRSV SC株在Marc145細胞中的一步生長曲線Fig.2 The one-step growth curve of PRRSV SC strain in Marc145 cell

2.2.2 自噬相關基因mRNA轉錄量的檢測將對照組和試驗組各時間點Ct值記錄整理，利用所建立方法的標準曲線將Ct值換算為拷貝數，以時間為橫坐標，拷貝數對數為縱坐標，作拷貝數對數-時間的線性曲線圖，其中拷貝數對應的絕對值為細胞數量。如圖3所示，具有自噬啟動作用的Beclin1 mRNA在感染PRRSV SC株前后轉錄量存在明顯差異，感染后PRRSV使Beclin1 mRNA轉錄量增加，且在12 h時其轉錄量已明顯高于對照組。感染后12～48 h期間Beclin1 mRNA轉錄量呈直線增加，48 h后其轉錄量增加緩慢，但仍高于對照組。如圖4所示，試驗組和對照組的ATG5 mRNA在36 h前轉錄差異不大，48 h時試驗組轉錄增多，并在72 h前保持持續增加，對照組從48 h時轉錄量雖有增加，但增加量較試驗組低。圖5顯示，試驗組與對照組ATG12 mRNA增長趨勢差異不大，試驗組轉錄量在60 h時達到峰值，而后開始下降；對照組轉錄量則從24 h時開始增加，持續增加至72 h。對試驗組與對照組的基因轉錄量進行組間方差分析，結果顯示，Beclin1(P=0.005<0.01)差異極顯著，ATG5(0.01

圖3 Beclin1 mRNA轉錄量拷貝數線性曲線圖Fig.3 Linear curve of copy number of Beclin1 mRNA expression

圖4 ATG5 mRNA轉錄量拷貝數線性曲線圖Fig.4 Linear curve of copy number of ATG5 mRNA expression

圖5 ATG12 mRNA轉錄量拷貝數線性曲線圖Fig.5 Linear curve of copy number of ATG12 mRNA expression

3 討 論

自噬相關基因對于自噬的發生及調控至關重要，了解相關基因在通路中的功能作用，對于自噬研究十分必要。Beclin1基因作為細胞自噬的啟動基因和調控基因，其在乳腺癌[17-18]等疾病的發生中，常表現為下調，而在胃癌、肝癌疾病過程中，卻表現為明顯上調。在多種神經系統疾病中，研究人員對Beclin1的檢測結果顯示其轉錄量降低[19-20]。Beclin1參與許多疾病過程，也與病毒感染關系密切。已有研究表明PRRSV感染細胞后，Beclin1能通過調節其他ATG蛋白的定位對自噬活性進行調節[21]。但Beclin1在細胞內如何被因子調控，PRRSV的變異對其表達有怎樣的影響等此類問題目前并不清楚。ATG5與ATG12在自噬發生過程中常形成復合物，能通過促進LC3蛋白脂質化從而促進細胞自噬，并對細胞抗病毒天然免疫也有積極作用[22]。細胞自噬在一定程度上能增強抵御病毒感染的能力，研究ATG5與ATG12對揭示細胞天然免疫，增強細胞抗病毒能力具有重要意義。

本研究對對照組和試驗組的自噬相關基因mRNA進行測定，發現PRRSV感染Marc145細胞后使Beclin1、ATG5、ATG12 mRNA的轉錄量增加，且三個基因 mRNA轉錄量在較長時間內一直持續在較高水平，與自噬相關蛋白LC3Ⅱ表達量符合[23]。PRRSV在60 h左右達到增殖峰值，而此時刻相關基因的mRNA也處于持續較高轉錄量的狀態，這與陳全剛[24]得出的PRRSV能利用細胞自噬促進自身增殖相符合，也與Rab11a以自噬方式幫助PRRSV結果相一致。對照組細胞在維持36 h左右后相關基因 mRNA轉錄量開始升高，但與試驗組相比仍相對較低，推測在維持狀態的Marc145細胞在36 h左右已開始發生自噬，在48～72 h時相關基因mRNA轉錄量穩定在稍高水平，且仍有隨時間推移繼續升高的趨勢，可能是發生自噬后細胞雖能利用自噬物質暫時維持自身代謝活動，但由于環境中營養物質的消耗殆盡發生了廣泛的自噬，后期自噬增強逐漸發展為凋亡。PRRSV在24 h時快速增殖，病毒量在24～60 h均處于較高狀態，結合自噬基因轉錄水平可以基本說明PRRSV增殖與細胞自噬在一定程度范圍內呈正向作用，即PRRSV能誘導細胞自噬并利用自噬產物幫助自身增殖。

本研究雖發現了Beclin1、ATG5與ATG12 mRNA的轉錄規律、PRRSV 增殖與細胞自噬的相關聯系，但病毒增殖與細胞自噬怎樣相互作用，病毒的變異對細胞自噬有怎樣的影響等問題仍有待研究。

4 結 論

PRRSV感染Marc145細胞，實時熒光定量方法測得Beclin1、ATG5和ATG12 mRNA在感染后轉錄量增加；其轉錄規律與細胞病變、PRRSV增殖規律呈正相關。