組蛋白去乙酰化酶抑制劑對食管癌細胞抗腫瘤活性及其相關機制的研究進展

吳 健，王晶晶綜述，楊鯨蓉，曾志勇審校

0 引 言

食管癌是全世界高發的惡性腫瘤之一,近20年食管癌的發生率增加了50%[1]。在我國，食管癌發病率居各類惡性腫瘤第五位，我國食管癌的發病人數及死亡人數均超出世界50%以上[2]。就目前而言，主流的食管癌治療方式有如下幾類，分別為：化學治療、放射治療、外科治療、綜合治療。食管癌患者即使經過綜合治療，術后5年生存率仍小于30%。食管癌術后高復發率及高死亡率給食管癌的治療帶來了挑戰。食管癌發病過程的機制至今未闡明，故尋找食管治療新靶點提高療效、減少復發是亟待解決的難題。在表觀遺傳學理論的基礎之上，發現了一類新型靶向抗腫瘤藥物，即組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor，HDACi)，其治療腫瘤效果良好,能夠為食管癌的研究和治療提供新的思路。

1 HDAC抑制劑

表觀遺傳學是不涉及DNA序列改變的可遺傳的基因表達變化研究，主要是從蛋白質、染色質和RNA等多個水平調控基因表達[3]。在食管癌腫瘤的發生發展全過程中，HDAC其抑制劑起到了關鍵的調控作用[4-5]。以乙酰化、磷酸化、甲基化修飾等為代表的組蛋白的共價修飾作用，往往會對基因的表達調控產生重要影響。已有研究結果顯示，甲基化、乙酰化在食管癌的發生和發展中具有重要的作用[6]。組蛋白乙酰化及去乙酰化修飾是基因表達調控最主要的驅動力之一，組蛋白乙酰基轉移酶(histone acetyltransferase，HATs)和HDACs發揮了聯合催化作用，進而對染色質各區域核心組蛋白的乙酰化程度起到了決定性的作用，直接關乎基因轉錄活化以及轉錄抑制間是否能夠保持平衡狀態。多項研究結果顯示，在腫瘤發生與演進過程中，HATs/HDACs調節的失衡經常扮演了一個關鍵的角色。 HDACs對腫瘤發生于發展的促進途徑是多樣化的，分別能從基因轉錄調控、分化凋亡、信號轉到等渠道發揮作用[7-8]。HDAC蛋白的表達以及活性會在HDACi的作用下被抑制，在這一過程中，組蛋白會迅速恢復乙酰化狀態，與此同時，HAT的催化作用會有所增強，有助于抑制腫瘤細胞的存活[9]。

目前所有HDACi按照化學結構可分為4大類:以MGCD0103、MS-275等為代表的苯酰胺類、以TSA、PXD-101、SAHA等為代表的異羥肟酸類、以丁酸鈉、丙戊酸等為代表的羧酸類、以Trapoxin、Acidipin、FK-228等為代表的環肽類。選擇性HDAC抑制劑與廣譜HDAC抑制劑是以對HDAC的特異性為標準所劃分出的兩種抑制劑類型，后者又可以細分為I類HDAC選擇性及II類HDAC選擇性這兩種類型。大部分異羥肟酸類HDACI均會對I類、II類HDAC產生廣譜抑制作用，而Tubacin則會對HDAC6產生特異性抑制；MS-275對I類HDAC及HDAC9具備選擇性等[10-13]。

2 HDACis抗腫瘤機制

2．1HADCi誘導腫瘤細胞凋亡HDACi對腫瘤細胞凋亡的誘導作用在誘導腫瘤細胞凋亡體內與體外的實驗研究中均得到了證實，HDACi誘導細胞凋亡的途徑有分多種，目前研究比較明確的有外源性途徑、內源性途徑、活性氧產生與激活的調控途徑。誘導外源性凋亡的途徑即上調死亡受體、提高受體通路以及耐受性，進而調控相關蛋白的合成與表達。最主要可以誘導死亡受體5表達，此時HDACi與死亡受體將產生協同作用，通過激活easpase3、easpase9、easpase10，促使腫瘤細胞凋亡。這也是HDACi對腫瘤細胞選擇性殺傷作用的機制之一[14]。誘導內源性凋亡的途徑亦被稱作線粒體途徑，主要依靠以線粒體/細胞色素c介導的的凋亡途徑來激活caspase，進而誘導腫瘤細胞凋亡[15]。調控與凋亡相關的蛋白HDACi能夠誘導細胞凋亡，主要依靠對家族蛋白中的促凋亡擔保、抗凋亡蛋白的上調或下調作用來實現，進而使多條信號轉導通路活化，誘導細胞凋亡。但受腫瘤細胞中促凋亡蛋白以及抗凋亡蛋白基礎水平差異的影響，HDACi增強促凋亡蛋白與降低抗凋亡蛋白作用往往也會有所不同。

2．2HADCi誘導腫瘤細胞周期停滯細胞周期調控異常是腫瘤發生的重要機制。HDACi可以通過調節細胞周期蛋白和細胞周期蛋白激酶抑制物的表達，誘導腫瘤細胞發生G1和/或G2期停滯。盡管不同類HDACi的化學結構存在較大差異，但基因調控模式卻十分相似。HDACi誘導激活CDKN1A基因最常見。CDKN1A編碼p21cipl，p21可以抑制CDK2和CDK4/6的活性，使去磷酸化Rb水平升高，抑制轉錄因子E2F所調控基因的激活，使細胞周期停滯于G1期。此外，HDACi可使多種細胞發生G2期停滯，這可能是因為HDACi特異性抑制cyclinD1啟動子組蛋白H4的乙酰化水平，抑制G2期cyclinD1的轉錄和表達[16]。

2．3HADCi促進腫瘤細胞分化誘導細胞發生分化從定義上來講，誘導細胞分化的核心在于發揮誘導分化劑的作用，誘導腫瘤細胞的分化途徑，使其接近于正常細胞的生長方式或生長速度等，盡可能的誘使其朝著正常細胞轉變。誘導腫瘤細胞分化的特點在于誘導腫瘤細胞向高分化的方向轉變，而不是單純的殺傷腫瘤細胞[17]。由此可見，這種治療方式更為安全，對患者的損傷更小。就現階段而言，此項技術在腫瘤治療領域已經得到了認可與應用。

2．4HADCi抑制腫瘤細胞血管的生成HDACi對腫瘤習慣生成的抑制作用主要依靠對腫瘤細胞中的低氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)與血管內皮因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)受體降解的抑制來發揮作用[18]。相關研究表明，無論在生物體內還是體外，FK228均會對血管的生成產生強抑制作用。以未處理的細胞作為空白對照，對比FK228 處理24 h的Hela細胞，處理過的細胞中的VEGF 受體、FLT等表達嚴重受滯，且這些因子大多為刺激血管生成的因子。與此同時，以pVHL、NF等為代表的抑制血管生成因子則被誘導表達[19]。因此，在許多文獻中都將HDACi列為一種新型抗腫瘤藥物，集中闡釋了其對HDAC的抑制作用，強調了其在抗腫瘤血管生成、腫瘤細胞誘導凋亡等方面的特性。

3 HDACis抗腫瘤優勢

相比于其他抗腫瘤藥物，HDACis的優勢是顯而易見的，突出體現在如下幾個方面：首先，HDACis會在不顯著危害正常組織細胞的同時對腫瘤細胞產生生長抑制或放射增敏作用。就目前而言，已經逐步開啟了HDACis抗腫瘤治療的臨床一期以及二期研究。以LAQ824、pyroxamide、MS-275、SA-HA等為代表的新型HDACis的發現，有望為腫瘤治療帶來新的希望。隨著此領域研究工作的不斷深入，新的HDACis對于腫瘤疾病的治療價值已經得到廣泛認可，相關臨床實驗工作也在有序展開。其次，HDACis既能夠單獨作為抗癌藥物而使用，還能夠與其他抗癌藥物或放療聯用，達到協同增效的作用。HDACis與全反式維甲酸聯合應用于急性早幼粒細胞白血病的治療，取得了良好的臨床效果。此外，組蛋白去乙酰化酶抑制劑能夠對膀胱腫瘤有一定的抗癌效應，其不僅表現在能夠阻滯膀胱腫瘤細胞周期和誘導細胞凋亡，而且還能夠提高順鉑對順鉑耐藥的人膀胱癌細胞的協同抗腫瘤作用。主要機制表現為阻滯細胞周期與激活凋亡基因[20]。另外，目前醫學界也就去乙酰化化酶抑制劑苯甲酰胺CI-994與傳統抗癌藥吉西他濱的聯用展開了臨床試驗，并取得了理想的預期效果。隨著對腫瘤發生機制及HDACis構效關系地深入研究，HDACis的設計開發對腫瘤的治療產生重要意義。

4 HDACis與食管癌的關系

目前HDACis在食管癌中的應用尚處于起步階段，國內外其相關的研究并不多。Murakami等[21]研究了一種新型的HDAC抑制劑CHAP31，可誘導caspase9的裂解和上調Bax/Bcl-2比率，從而誘導食管癌細胞凋亡。Furutani等[22]應用新型HDAC抑制劑OBP-801/YM753可抑制氟尿嘧啶誘導的胸苷酸合成酶的表達，增強食管癌細胞對氟尿嘧啶和放療的敏感性。Tzao等[23]在體外及小鼠腫瘤模型中應用HDAC抑制劑SAHA可誘導食管癌細胞E-cadherin的表達，抑制食管癌細胞遷移，侵襲和細胞外基質黏附。

近年的研究發現HDACs在食管癌的發生和發展中具有一定作用。Toh等[24]研究表明食管癌細胞的組蛋白H4在腫瘤侵襲的早期階段顯著增加了高乙酰化，此后，根據腫瘤進展程度，轉化為低乙酰化。若食管癌患者的癌細胞低表達HDAC1，那么其會面臨著較高的癌細胞侵犯食道壁深層的風險。Langer等[25]發現HDAC2高表達與食管腺癌的腫瘤侵襲性相關。這提示HDAC2與腫瘤的分化、增殖、侵襲、疾病進展和不良預后有關。在食管鱗癌患者，癌組織和癌旁組織中HDAC2呈現高表達。HDAC抑制劑TSA通過抑制HDAC2的表達，減少HDAC2誘導的MMP-2和MMP-9表達，達到抗腫瘤侵襲作用[26]。Zhang等[27]通過實時RT-PCR檢測食管癌標本及癌旁組織發現HDACl高表達。利用質粒為基礎的RNA干擾(RNAi)降低HDACl的表達，結果表明，通過抑制HDACl的表達可誘導食管癌細胞凋亡，并增強食管癌細胞的放射敏感性。Chen等[28]研究表明NAD(+)依賴的III型HDAC(SIRT1)與食管癌淋巴管浸潤及預后相關。因此，HDACs可成為食管癌治療的新靶點。

5 HDAC及其抑制劑的抗食管腫瘤細胞活性

5.1丙戊酸鈉(valproicacid，VPA) VPA屬于傳統抗癲癇藥物的一種，被歸于短鏈脂肪酸(SCFA)的范疇內。其優勢在于患者耐受性好且不會產生明顯的副作用。研究顯示，丙戊酸具有HDACi活性，能特異性的作用于HDACⅠ與HDACⅡ，具有明確的抗腫瘤作用[29]。目前關于丙戊酸應用食管癌的研究少見，僅2篇文獻報道應用丙戊酸作為食管癌細胞放射增敏劑。丙戊酸可通過抑制非同源末端連接，延長放射誘導的食管癌DNA雙鏈斷裂；另外，丙戊酸可誘導組蛋白H3和組蛋白H4的乙酰化及誘導細胞凋亡，因此，丙戊酸可作為食管鱗癌放療的增敏劑，提高放射療效[30-31]。但丙戊酸對食管癌細胞的直接作用尚未見報道。

5.2曲古霉素A(trichostatinA，TSA) 曲古霉素A亦稱曲古抑菌素A(TSA)的藥用價值在近些年來被挖掘出來，被人們視作一類新型抗腫瘤藥物。但是，受HDACi藥物以及腫瘤特異性的影響，目前尚未完全闡明這種抑制劑的具體機制。已有研究結果顯示，TSA能夠對多種腫瘤細胞的增殖產生抑制作用，主要通過劑量依賴性以及時間依賴性方式來發揮作用[32]。EC9706 細胞會在施加以特定濃度 TSA的條件下發生凋亡現象，這一過程主要與TSA 作用EC9706 細胞引起 Bax、Bcl-2及caspase．8、caspase．9表達水平改變有關。Dong等[33]研究表明HDAC抑制劑曲古抑菌素A和丁酸鈉可通過調節Bmi-1的表達，逆轉食管鱗KYSE-150R細胞獲得性放射抵抗。Ma等[34]研究表明HDAC抑制劑TSA通過抑制PI3K/Akt和ERK1/2通路激活，可抑制食管癌細胞生長。

5.3丁酸鈉(sodiumbutyrate) 丁酸鈉屬于腸道黏膜營養劑的一種，其屬于四碳脂肪酸鹽。相關文獻顯示，丁酸鈉能夠對多種腫瘤細胞的增殖產生抑制作用，最典型的為結腸癌、肝癌、胃癌等，通過對腫瘤細胞分化以及基因表達等生理活動的影響，引發細胞凋亡現象。研究表明丁酸鈉通過超乙酰化導致DNA和組蛋白分離，對NDRG1基因表達產生誘導作用并對食管癌EC9706細胞生長產生抑制作用[35]。在這一過程中，食管癌細胞分化會受到刺激而增強。因此，丁酸鈉可作為食管癌的誘導分化劑。

6 展 望

通過本研究可知，國內外學者就組蛋白去乙酰化酶抑制劑在腫瘤治療領域的作用進行了深入的探究。就現階段而言，組蛋白去乙酰化酶抑制劑已經逐漸成為一種前景較好的新型抗腫瘤藥物。組蛋白去乙酰化酶抑制劑在食管癌治療領域的應用價值極高，其能夠對食管癌細胞的生長產生抑制作用，增強食管癌細胞的放射敏感性并誘導其凋亡。不過，從客觀上來講，目前關于此課題的研究尚未成熟，如尚未探明組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導食管癌細胞停滯與凋亡的具體機制，尚未探索出對食管癌特別敏感的組蛋白去乙酰化酶抑制劑的合成篩選途徑等。另外目前還并未針對組蛋白去乙酰化酶抑制劑單獨使用以及與其他藥物合并使用的問題進行臨床實驗對比。盡管已有研究仍然有諸多不成熟之處，但是從客觀上來講，隨著此領域研究工作的不斷深入，組蛋白去乙酰化酶抑制劑在食管癌臨床治療領域的價值必然會不斷增強，食管癌患者的生存率也將大幅提升。