人NSD2基因特異性shRNA慢病毒載體構建及沉默效果評價

王紅紅 潘云 李艷

【摘要】目的：構建針對人NSD2基因的shRNA慢病毒載體，并觀察其在人腎293T細胞中沉默效果，從而為進一步研究NSD2基因在其他腫瘤細胞系中的表達及影響莫定基礎。方法：以NSD2基因為靶標，設計并合成2條互補寡核苷酸序列（NSD2 shRNA-1，NSD2 shRNA-2）克隆至PLKO-βuro重組慢病毒載體中，形成新的重組慢病毒載體PLKO- NSD2-puroe然后與包裝質粒PMDL、PV5VG、PREV在 293T細胞中進行包裝，產生重組慢病毒顆粒，并進一步感染293T細胞，通過提取蛋白進行Western Blot檢測NSD2基因沉默效果。結果：通過PCR鑒定和DNA測序鑒定證明NSD2 shRNA-1，NSD2 shRNA-2重組shRNA慢病毒表達質粒中插入了目的DNA片段。且通過Western Blot檢測NSD2基因沉默效果，證明了NSD2 shRNA構建效果不錯，可以進一步運用于與NSD2相關的腫瘤細胞細胞系中。結論：成功構建了人的NSD2基因shRNA真核表達的慢病毒載體，為進一步應用于其他與NSD2相關的癌細胞系，針對NSD2基因的腫瘤治療研究莫定基礎。

【關鍵詞】NSD2：shRNA：慢病毒：載體構建：293T細胞

NSD2又稱MMSET（multiple myelomaSET domain）或者WHSC1（Wolf- Hirschhorn syndrome candidate 1），位于染色體4p16.3上，是NSD蛋白家族的重要成員之一[1]。研究發現NSD2基因的表達水平與多種腫瘤的發生發展密切相關。比如，最初發現的因NSD2單倍體計量不足導致的以腦部發育過小和智力發育遲緩為特點的沃爾夫綜合征（Wolf Hirschhornsyndrome）[2]。研究顯示NSD2在多類腫瘤中存在高表達，且與多種腫瘤的發生及惡性程度有關[3]如：淋巴系統腫瘤[4]，骨肉瘤[5]，乳腺癌，胰腺癌等。且研究顯示NSD2在神經母細胞瘤[6]，結腸癌，肺癌等多種腫瘤中存在過表達[1]，提示NSD2有潛在的致瘤作用，表明NSD2可作為相關腫瘤診斷的理想標志物[1，7]且NSD2的致癌作用首先在MM（Mutiple Myeloma，多發性骨髓瘤）中證實的[8]，t（4；14）（p16；q32）易位是MM中最常見的易位之一，與MM的不良預后有直接關系[8，9]。多項研究報道，NSD2的過表達在有t（4；14）（p16；q32）易位的MM病例中普遍存在，并成為這種亞型MM的一個關鍵致癌因素[10]。shRNA（shorthairpin RNA）的發現，已成為特異性抑制基因快捷高效表達的一種技術手段。且近年來慢病毒載體表達的shRNA介導的基因沉默被廣泛應用于基因研究，藥物靶點的篩選等。因此為更好的研究NSD2蛋白在基因區分部特點，以及NSD2基因與其他基因的相關性，進一步分析NSD2的轉錄活性，本研究從shRNA入手，構建了針對NSD2基因的shRNA慢病毒干擾載體，并將該基因的沉默作用侵染到293T細胞中，并為進一步分析NSD2基因在其他腫瘤細胞系中的表達機制提供基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人腎293T細胞株，TRC2-βLKO-βuro慢病毒表達載體質粒，大腸桿菌DH5a感受態細胞，慢病毒包裝質粒PMDL.PV5VG、PREV全都由中國科學院生物物理研究所李國紅研究員實驗室饋贈。

1.2 方法

1.2.1 人NSD2基因靶向shRNA序列的設計與合成

在NCBI網Gene數據庫搜索得到人NSD2基因mRNA序列（Gene ID：NM-001042424.2-CCDS33940.1）的轉錄本，PCR引物設計按照shRNA的設計原則，參照人NSD2基因序列完整的轉錄本1（NM-001042424.2），再根據TRC2-βLKO-βuro載體的特點（圖1）。酶切位點為Kpn1與ECOR1，設計合成2對shRNA單鏈寡核苷酸片段（表1）。將設計的引物發送至上海生工生物有限公司合成，得到干粉oligoDNA，先用ddH2O配置成100uM的溶液。然后引物退火：shRNA#1/2 F/R（100um）各取10ul，5XGC buffer 8ul，ddH2O 12ul共40ul，

沸水（100℃）域煮5min后，用一個燒杯連同引物加水一塊取出，室溫下使引物自然冷卻，即可形成雙鏈的shDNA。

1.2.2 NSD2-shDNA片段與PLKO-βuro表達載體的構建

將TRC2-βLKO-βuro載體分別用Kpn1與ECOR1進行雙酶切，體系為TRC2-PLKO-βuro載體質粒3ug，限制性內切酶Kpn1與ECOR1分別1ul，10X buffer 3ul，ddH20補足至30ul。然后將NSD2-sbDNA片段與PLKO-βuro表達載體連接。連接體系：T4酶0.5ul，載體V（PLKO）0.5ul，10XT4 buffer 2ul，Insert（退火后引物稀釋10倍用）1ul，ddH2O 16ul共20ul。16℃連接過夜。

1.2.3 重組NSD2-shRNA干擾表達質粒的鑒定

將連接產物轉化至大腸桿菌DH5a。取80ul混勻的菌液，均勻涂布于含Amp+100ug/ml的LB固體培養基中，37度培養過夜至長菌。然后隨機挑取3個單克隆菌落，分別接種于4ml含50ug/ml的氨芐青霉素LB液體培養基中，恒溫37℃搖床，200rpm/min震蕩搖過夜。次日用生工小提中量質粒提取試劑盒提質粒，并送北京美吉生物測序。測序引物為人的U6通用引物。測序結果與引物序列比對，比對結果（如圖2）。

1.2.4 病毒侵染建立穩定細胞系

1.2.4.1 慢病毒包裝 （1）當293T細胞生長密度至細胞基區的65-70%時，開始轉染細胞。 （2）取1.77ug shRNA載體質粒、1.152ugpMDL質粒、0.62ugpVSVG質粒和0.469ug pREV質粒到一個新的1.5ml無菌EP管中與DMEM共250ul混合均勻，另一管lout的biotool溶液與DMEM共250ul混合均勻，室溫放置5min后，將上述的兩管溶液在室溫下混合均勻，在室溫靜置20min。全部轉移至待轉染細胞的細胞培養皿中混勻，將細胞放入培養箱中培養。 （3）轉染6-7小時后，用新鮮培養基，給已轉染的細胞換液并繼續培養。

（4）轉染48小時后將含有病毒顆粒的細胞培養基上清液轉移至新的15ml無菌離心管，再在細胞培養皿中加入3ml新鮮培養基繼續培養。

（5）24h后再次收取細胞培養基上清，與前次收取的含有病毒顆粒的細胞培養基合并，室溫下2000rpm，離心5min，用濾器過濾上清液到新無菌管中。

1.2.4.2 用慢病毒侵染細胞 （1）將待侵染的細胞傳代至3.5cm細胞培養皿中，當細胞貼壁時，吸棄細胞培養基。并將病毒懸液滴加在細胞表面，加入0.5ul 10mg/ml polybrene后混勻，37℃恒溫箱培養。 （2）侵染8小時后吸棄細胞培養皿中的液體，加入2ml新鮮的細胞培養基繼續培養。 （3）在細胞生長為80%，將細胞傳代至6cm細胞培養皿。細胞生長到80%細胞培養皿時，繼續傳代。

（4）24小時后，用加相應抗生素的培養基換液，大約7天后，存活下來的即為被慢病毒成功侵染的細胞。

1.2.5 Western Blot檢測NSD2基因沉默是否構建成功。

培養72h后收細胞。用500ul的RIPI裂解液（50mMTris：150mM Nael，0.5%TrionX-100；0.1 %DOC，1mMEDTA）同時加入蛋白酶抑制劑終濃度為（1mM PMSF，1000Xleupeptin，1000X Aprotinin）水浴超聲裂解細胞提取蛋白。加5XSDS loading終濃度為2X，100℃煮樣15min。Westem Blot檢測，先將蛋白定量，10% SDS-βAGE電泳跑膠，濕轉（360mA，90min）轉移至NC膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1小時。敷一抗（NSD2 ab75359 1：1000；Tubulin 1：5000），4℃孵育過夜，用1：10000的HRP標記的抗鼠二抗室溫孵育1小時。洗膜TBST洗5次/7mino化學發光試劑盒顯影。

2 結果與分析

2.1 NSD2-shDNA片段與PLKO-βuro表達載體的構建鑒定

針對NSD2構建的2種shRNA-NSD2-PLKO-βuro表達載體經測序驗證，結果表明插入的核苷酸序列完全正確無突變堿基（圖2），證實成功構建2個針對NSD2基因的shRNA干擾表達載體。將兩個質粒分別命名為shRNA-NSD2-βLKO-1和TshRNA-NSD2-βLKO-2。

2.2 Western Blot檢測逆轉錄病毒轉染的人NSD2基因沉默效果

將shRNA-NSD2-βLKO-1與shRNA-NSD2-βLKO-2干擾質粒通過慢病毒侵染后建立穩定細胞系，以未轉染的293T細胞，以及shRNA-NSD2-βLKO-1與shRNA-NSD2-βLKO-2瞬時轉染293T細胞的樣品作為對照組。Western Blot結果顯示瞬時轉染的NSD2表達抑制有所下降，通過慢病毒侵染建立穩定細胞系的NSD2表達基本全部沉默。圖3。

3 討論

NSD2（MMSET或WHSC1）是一類組蛋白賴氨酸甲基轉移酶，能催化H3第36位發生二甲基化（H3K36rne2）[11]，在腫瘤的發生發展中發揮著重要作用[5，12]。研究表明NSD2的高表達對基因的影響可能涉及：P53通路；NF-KB通路；整合素通路；細胞周期調控機制；c-MYc的表達等[7，13，14]。并且NSD2與淋巴系統腫瘤等多種腫瘤中都存在表達的異常，與腫瘤的發展及預后密切相關。因此研究NSD2在基因區的表達水平，對探究腫瘤的特異性靶點以及相關抑制劑的研究具有重要臨床意義。

NSD2作為重要的組蛋白賴氨酸甲基轉移酶，在國內研究還比較少。因此為進一步闡明人NSD2基因的功能及表達，本研究成功構建了2個人NSD2基因的shRNA干擾表達載體shRNA-NSD2-βLKO-puro。通過Western Blot檢測慢病毒侵染的人NSD2基因沉默效果表明，對照組NSD2蛋白的表達與shRNA-NSD2-βLKO-Puro慢病毒侵染的NSD2蛋白表達水平有顯著差異。表明構建的2個shRNA真核表達載體能有效抑制293T細胞中NSD2的表達。表明其下調人NSD2基因表達。其中以慢病毒侵染的shRNA NSD2沉默效果最佳。總之，本研究成功構建了2個針對人NSD2基因的shRNA干擾表達載體，可顯著降低293T細胞中 NSD2基因的表達，為進一步研究NSD2基因在其他癌細胞系中的表達及影響機制奠定了基礎。

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