ICAM—1在小鼠放射性頜下腺損傷中的表達變化

徐楊 韋力

【摘要】目的：探討小鼠放射性頜下腺損傷ICAM-1的表達變化，闡明放射誘導唾液腺損傷的可能機制。方法：將小鼠隨機分為對照組、放射組，放射組給予60Coγ射線一次性15Gy照射，對照組給予0Gy照射。照射后30d檢測小鼠唾液量，取小鼠頜下腺行Masson染色觀察膠原沉積情況、免疫組化觀察ICAM-1蛋白的表達。結果：與對照組相比，放射組小鼠唾液量明顯減少（P<0.05），膠原纖維沉積增多，ICAM-1蛋白表達明顯升高（P<0.05）。結論：放射誘導的唾液腺間質纖維化機制可能與ICAM-1的表達升高有關。

【關鍵詞】放射；頜下腺；ICAM-1

放射性唾液腺損傷是放射治療頭頸部惡性腫瘤的常見并發癥之一。據統計，大約70%的患者在接受頭頸部放療后會出現不同程度的放射性口腔干燥癥，給患者生活造成極大困擾m臨床上表現為口腔灼痛感，味覺異常，吞咽和說話困難以及食欲不振，并增加齲齒和口腔感染的風險，不僅影響患者生活質量，甚至可能會導致患者中斷放療。

關于放射性口腔干燥癥的機制，雖然國內外學者從多方面進行了大量的研討，但尚未有定論。因此，探討放射性唾液腺損傷的機制，對于尋找有效防治措施減少放射性口腔干燥癥的發生，提高患者生活質量至關重要。

研究表明，照射后唾液腺早期的炎性反應是其功能受損的重要原因，而晚期功能出現不可逆損傷的重要機制之一是腺體間質纖維化[2]。細胞間黏附分子-1（Intercellular Adhesion Molecule-1，ICAM-1）是體內重要的黏附分子之一，參與多種病理生理過程，在放射性肺損傷、腦損傷等多種放射導致的急慢性損傷中起重要作用，不僅能介導早期炎性反應，而且與晚期間質纖維化密切相關[3，4]。

本實驗旨在探討放射后小鼠頜下腺ICAM-1的表達變化，闡明放射后唾液腺功能不可逆損傷的可能機制，為防治放射性口腔干燥癥提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

體重30-34g的雌性昆明小鼠（廣西醫科大學實驗動物中心提供）12只隨機分為對照組和放射組兩組，每組6只。

1.2 主要試劑和儀器

6oCo照射源（廣西醫科大學第二附屬醫院），毛果蕓香堿、改良Masson三色染色液（北京索萊寶科技有限公司），石蠟切片機、光學顯微鏡（德國leica公司），ICAM-1抗體（美國Abeam公司）。

1.3 照射方法

小鼠經3.5%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉后，置于60Coγ治療機平臺，使頸部充分暴露于射線下，其它部位受鉛板保護避免照射。放射組給予60Coγ射線一次性15Gy照射，對照組照射劑量0。

1.4 唾液量的測定

照射后30d檢測小鼠唾液量：準備數個小棉球，稱重記為總干重，小鼠麻醉后皮下注射毛果蕓香堿（2mg/kg），將小棉球放入小鼠舌下，隨時更換。30min后稱量棉球重量記為總濕重。唾液分泌量一總濕重-總干重。按照1g/ml計算唾液體積。

1.5 頜下腺樣本的采集

分離取出小鼠頜下腺放入4%中性甲醛中固定，24h后脫水、透明、浸蠟、包埋、切片。切片厚度4μm。

1.6 Masson染色

切片脫蠟至水，入Bouin液，于37℃的溫箱內2h進行媒染。水洗后天青石藍滴染2min，水洗后Mayer蘇木素滴染2min。水洗后酸性乙醇分化液分化數秒，流水沖洗10min。麗春紅品滴染10min。水洗后磷鉬酸溶液處理10min。傾去上液，滴入苯胺藍染色液染5min。常規脫水、透明、封片。

1.7 免疫組化法檢測小鼠頜下腺ICAM-1蛋白的表達

切片脫蠟至水，高壓修復，3%HZOZ孵育10min，血清封閉15min，甩去多余液體滴加一抗ICAIM-1（稀釋比1：2000），4℃過夜。次日復溫50min，滴加二抗，室溫孵育30min；DAB顯色。復染，蘇木精染色2min，分化液分化，常規脫水、透明、封片。

1.8 統計學方法

將免疫組織化學切片置于顯微鏡下觀察，每張切片隨機選取5個視野拍照，采用Image Pro Plus圖像分析軟件對ICAM-1蛋白的表達進行分析，實驗數據采用SPSS統計軟件進行統計學分析，均數的比較采用獨立樣本t檢驗，數據均以均值±標準差（x±s）表示，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 唾液量測定

由表1可知，在放射后30d，與對照組相比，放射組小鼠唾液量明顯減少，差異具有統計學意義（P<0.05）。

2.2 Masson染色結果

膠原纖維主要沉積在血管及導管周圍，如圖1所示，對照組僅有少量沉積，而放射組可觀察到大量膠原纖維沉積于血管及導管周圍，說明放射組腺體內出現間質纖維化。

2.3 小鼠頜下腺ICAM-1蛋白的表達

顯微鏡下免疫組化染色觀察，由表2和圖2可見：ICAM-1陽性表達主要位于血管內皮、各級導管上皮細胞的包膜和胞質內。對照組可見少量表達，與對照組相比，放射組陽性表達明顯增強，差異具有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

臨床上發現，接受頭頸部放療的患者因為唾液腺受到不同程度的損傷導致唾液分泌減少，造成放射性口腔干燥癥，嚴重影響放療后患者的生活質量。

在本實驗中，通過檢測小鼠唾液量，發現放射組小鼠唾液量明顯減少，這說明實驗造模是成功的。通過Masson染色顯示，放射組小鼠頜下腺血管及導管周圍出現大量膠原纖維沉積，說明放射后的腺體出現了間質纖維化，與既往研究相符[5]。

ICAM-1作為一種重要的黏附分子被認為是導致放射后急性期炎癥和后期纖維化的重要因子。它主要在免疫細胞和血管內皮細胞上表達，可以誘導白細胞向受損組織中遷移[6]。體外培養人血管內皮細胞，發現照射后ICAM-1表達持續增加[7]。此外，ICAM-1也被證明是輻射誘導的肺內皮組織中炎性細胞遷移的必需條件，并具有刺激纖維化因子分泌的功能，參與放療后的肺纖維化過程[8]。

ICAM-1在唾液腺血管內皮和導管上皮細胞均有所表達，Saito I等證明ICAM-1在舍格倫綜合征中參與誘導淋巴細胞浸潤[9]。Kapsogeorgou EK等對舍格倫綜合征患者的唾液腺活檢中也發現31%的導管上皮ICAM-1表達強烈，并通過體外實驗表明唾液腺上皮ICAM-1的高表達可能在發病機制中起重要作用[10]。

ICAM-1在放射性唾液損傷的表達變化及其是否發揮作用尚未見報道。我們推斷ICAM-1在放射誘導的唾液腺間質纖維化的過程中起重要作用，是放射性口腔干燥癥的機制之一。在本實驗中，通過免疫組化染色觀察和統計，結果顯示，與對照組相比，放射組小鼠頜下腺中ICAM-1蛋白表達明顯增加。

綜述所述，放射后唾液腺ICAM-1蛋白表達增加可能是導致腺體內膠原纖維沉積增加，促進腺體纖維化，加重唾液腺損傷程度，使唾液分泌減少的重要原因。抑制放射后ICAM-1的表達可能是防治放射性口腔干燥癥的有效措施。

參考文獻

[1]Mossman K，Shatzman A，ChencharickJ.Long-term effects ofradiotherapy on taste and salivaryfunction in man[J].Int I RadiatOncol Biol Phys，1982，8（06）：991-997.

[2]Kamiya M，Kawase T，Hayama K，etal.X-Ray-Induced Damage to theSubmandibular Salivary Glandsin Mice：An Analysis of Strain-Specific Responses[J].Biores OpenAccess，2015，4（01）：307-318.

[3]張振勇，曹秋婷，吳榮.放射性肺損傷中核因子κB和細胞間黏附分子1的表達及意義[J].中國醫科大學學報，2014（02）：155-158.

[4]楊靜，趙博，張雪寧.放射性腦損傷大鼠腦組織細胞間黏附分子-1表達觀察[J].山東醫藥，2017（07）：40-42.

[5]Xu L，Yang X，Chen J，et al.Simvastatin attenuates radiation-induced salivary gland dysfunctionin mice[J].Drug Des DevelTher，2016，10：2271-2278.

[6]Kishimoto T K，RoTh1einR.Integrins，ICAMs，andselectins：role and regulationof adhesion molecules inneutrophil recruitment toinflammatory sites[J].AdvPharmacol，1994，25：117-169.

[7]Gaugler M H，Squiban C，vander Meeren A，et al.Late andpersistent up-regulation ofintercellular adhesion molecule-1（ICAM-1）expression by ionizingradiation in human endothelialcells in vitro[J].Int I RadiatBiol，1997，72（02）：201-209.

[8]Hallahan D B，VirudachalamS.Intercellular adhesionmolecule 1 knockout abrogatesradiation induced pulmonaryinflammation[J].Proc Natl AcadSci U S A，1997，94（12）：6432-6437.

[9]Saito I，Terauchi K，ShimutaM，et al.Expression of celladhesion molecules in thesalivary and lacrimal glands ofSjogren's syndrome [J].J Clin LabAnal，1993，7（03）：180-187.

[10]Kapsogeorgou E K，Dim itriou ID，Abu-Helu R F，et al.Activationof epithelial and myoepithelialcells in the salivary glandsof patients with Sjogren'ssyndrome：high expression ofintercellular adhesion molecule-1（ICAM.1）in biopsy specimensand cultured cells[J].Clin ExpImmunol，2001，124（01）：126-133.