DMOG對人牙周膜干細(xì)胞成骨分化和成血管能力影響的體外研究

張 璐，許 敏，李漢青，王 芳，何家才

目前由于嚴(yán)重的創(chuàng)傷、炎癥、腫瘤切除等因素導(dǎo)致的頜骨缺損的治療面臨巨大挑戰(zhàn)，而自體骨和異體骨在臨床應(yīng)用受限，運(yùn)用基因工程技術(shù)修復(fù)骨缺損成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)[1]。低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible-1α，HIF-1α)是一種低氧條件下被激活的轉(zhuǎn)錄因子，能調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和多種基因的表達(dá)，但常氧下易降解[2]。有研究[3]證實(shí)HIF-1α基因轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有更好的成骨成血管能力，改善骨的修復(fù)與再生，然而其潛在風(fēng)險(xiǎn)阻礙了臨床應(yīng)用。二甲氧已二酰甘氨酸(dimethyloxalylglycine,DMOG)是人工合成的小分子脯氨酰羥化酶抑制劑，能夠穩(wěn)定常氧下HIF-1α的表達(dá)[4]，因此作為一種新的替代方案，有希望安全應(yīng)用于臨床。鑒于此，該實(shí)驗(yàn)運(yùn)用DMOG探討其對人牙周膜干細(xì)胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)體外成骨分化和成血管能力的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(FBS)(浙江天航生物科技有限公司)；胰酶消化液、RIPA 裂解液、蛋白濃度測定試劑盒、BCIP/NBT堿性磷酸酯酶試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；PBS緩沖劑(美國Solarbio公司)；DMOG(美國Selleck公司)；PCR引物(上海生物工程股份有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；茜素紅(美國Sigma公司)；HIF-1α兔單克隆抗體(美國CST公司)；血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)小鼠單克隆抗體(美國Santa Cruz公司),山羊抗鼠/兔二抗(北京中杉金橋公司)；PVDF 膜(美國Invitrogen公司)；CO2恒溫孵箱(美國Thermo公司)；熒光倒置顯微鏡(德國Leica公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Stratagene公司)；酶標(biāo)儀(美國Bio-tek公司)。

1.2方法

1.2.1hPDLSCs體外分離培養(yǎng) 收集12～28歲因正畸減數(shù)需要拔除的牙體牙周均健康的前磨牙，在超凈工作臺內(nèi)，無菌條件下，將牙齒牙冠向下用含3倍雙抗的PBS反復(fù)沖洗。用無菌刀片刮取牙根中三分之一的牙周膜組織，剪成約1 mm3的小塊，以5 mm間隔鋪于6孔板皿底，加入少量DMEM培養(yǎng)液(含20% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素),放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，4～6 h待組織塊貼壁，加入上述DMEM培養(yǎng)液2 ml。每3～5 d換液，7～15 d左右當(dāng)細(xì)胞從組織塊周圍爬出并達(dá)孔底60%左右時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測hPDLSCs表面標(biāo)志物 取第3代hPDLSCs，0.25%胰酶消化，PBS洗3遍，調(diào)整密度為4×106/ml的單細(xì)胞懸液，分裝到EP管中，每管0.2 ml。分別加入CD34-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD90-APC、CD105-PE、CD146-PE抗體和陰性對照，4 ℃避光孵育60 min，PBS洗3遍后重懸，用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3MTT法檢測hPDLSCs增殖能力與細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期的hPDLSCs，以4×103/孔的密度接種于96孔板，次日細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的DMOG(0、0.1、1、10、100 μmol/L)。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h，棄上清液，每孔加入100 μl標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(不含血清的DMEM培養(yǎng)基)和20 μl濃度5 g/L的MTT，37 ℃避光孵育4 h，棄孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μl的DMSO溶液，待甲臜充分溶解后，在酶標(biāo)儀上測定490 nm處的吸光度值，每組設(shè)5個復(fù)孔。

1.2.4Western blot檢測 取對數(shù)生長期的hPDLSCs，以1×105/孔的密度接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁至皿底80%，加入不同濃度的DMOG(0、0.1、1、10、100 μmol/L)，分別于12、24、72 h后，提取各組細(xì)胞總蛋白。BCA測定試劑盒測定各組蛋白濃度，調(diào)整各組濃度一致，99 ℃、10 min使蛋白變性，10% SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移到0.45 μm的PVDF膜上，5%BSA封閉液室溫下封閉1 h，分別加抗HIF-1α(1 ∶1 000)、抗VEGF(1 ∶800)、抗β-actin(1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜，相應(yīng)二抗1 ∶5 000室溫孵育1 h，經(jīng)ECL曝光成像。

1.2.5RT-PCR檢測 取對數(shù)生長期的hPDLSCs,以1×105/孔的密度接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的DMOG(0、0.1、1、10、100 μmol/L)，分別于1、3、7、14 d提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行RT-PCR定量檢測核心結(jié)合因子2(Runt-related transcription factor 2 ，RUNX2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨鈣素(osteocalin，OCN)、VEGF基因表達(dá)水平。按TRIzol試劑盒說明書提取各組細(xì)胞總RNA，使用PrimeScriptTM-PCR kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以此為模板，用目的基因的引物進(jìn)行擴(kuò)增和檢測。每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，PCR所有引物由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見表1。

1.2.6ALP染色 取對數(shù)生長期的hPDLSCs，以5×104/孔的密度接種于12孔板，次日更換為不同濃度DMOG的成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，每3 d換液，分別于成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后，加入One-StepTMNBT/BCIP溶液(PIERCE)染色，拍照。

1.2.7茜素紅染色 同1.2.6方法培養(yǎng)細(xì)胞，14 d時(shí)棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定30 min，蒸餾水洗3次，2%茜素紅染液染色30 min，雙蒸水沖洗，觀察拍照，每孔加入0.5 ml 10%的氯化十六烷基吡啶，室溫下待結(jié)節(jié)完全溶解，吸取上清液，在酶標(biāo)儀上測定562 nm處的吸光度值。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1hPDLSCs體外分離培養(yǎng)與鑒定采用組織塊法分離培養(yǎng)hPDLSCs，約7～15 d可觀察到有細(xì)胞從組織塊周圍爬出，細(xì)胞多呈長梭形并呈放射狀排列，見圖1。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，hPDLSCs表面抗原CD44、CD90、CD105、CD146呈陽性，CD34、CD45呈陰性，見圖2。

圖1 hPDLSCs體外培養(yǎng) ×100

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物

圖3 MTT法檢測DMOG對hPDLSCs增值能力和細(xì)胞活力的影響

2.2DMOG對hPDLSCs增值能力和細(xì)胞活力的影響MTT結(jié)果顯示：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，與空白對照組比較，培養(yǎng)72 h，0.1、1、10、100 μmol/L的DMOG組對hPDLSCs的增殖有明顯抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=103.991，P<0.05)，且這種抑制具有劑量依賴性(P<0.05)。在缺血清培養(yǎng)基中，與空白對照組比較，培養(yǎng)72 h，0.1、1、10 μmol/L的DMOG 組hPDLSCs的細(xì)胞活性明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.722，P<0.05)，100 μmol/L的DMOG組無明顯差異，表明缺血清條件下，一定濃度范圍的DMOG對hPDLSCs的細(xì)胞活力具有保護(hù)作用，見圖3。

2.3Westernblot檢測HIF-1α和VEGF蛋白水平的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示：空白對照組HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)水平較低，在DMOG的作用下，表達(dá)水平明顯增加，見圖4。

圖4 Western blot檢測HIF-1α和VEGF蛋白水平的表達(dá)

1：0 μmol/L組；2:0.1 μmol/L組；3:1 μmol/L組；4:10 μmol/L組；5:100 μmol/L組

2.4DMOG對hPDLSCs成骨分化和成血管相關(guān)基因表達(dá)的影響RT-PCR分別檢測1、3、7、14 d成骨成血管相關(guān)基因Runx2、ALP、OCN、VEGF的相對表達(dá)水平。結(jié)果表明：與空白對照組比較，DMOG處理的hPDLSCs在3～14 d時(shí)Runx2的表達(dá)水平緩慢增加(F=9.129、38.657、1 802.759，P<0.05)；ALP和OCN在14 d時(shí)基因表達(dá)水平明顯增加，其中10 μmol/L的DMOG組ALP、OCN基因相對于空白對照組表達(dá)分別為(6.597±0.682)(F=68.527,P<0.05)、(2.956±0.0425)(F=913.618，P<0.05)，而100 μmol/L的DMOG組成骨相關(guān)基因表達(dá)水平較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；VEGF在1 d時(shí)表達(dá)水平明顯增加并持續(xù)到14 d，且100 μmol/L的DMOG組表達(dá)水平最高(F=33.487，P<0.05)，見圖5。

2.5ALP染色及茜素紅染色成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d，ALP染色結(jié)果顯示：與空白對照組比較， 0.1、1、10 μmol/L的DMOG組ALP活性明顯增高，100 μmol/L的DMOG組明顯降低；茜素紅染色結(jié)果顯示：與空白對照組比較，0.1 μmol/L的DMOG組無明顯差異，1、10 μmol/L的DMOG組鈣結(jié)節(jié)生成量明顯增多，半定量分析顯示分別為空白對照組的1.6倍和2.1倍，100 μmol/L的DMOG組較空白對照組鈣結(jié)節(jié)生成明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=317.612，P<0.05)，見圖6、7。

3 討論

圖5 RT-PCR檢測成骨分化和成血管相關(guān)基因表達(dá)

圖6 ALP染色及茜素紅染色A：ALP染色；B：茜素紅染色

圖7 茜素紅染色的半定量分析

Seo et al[5]首次從人的牙周膜組織中成功分離出hPDLSCs，因具有多向分化潛能和克隆形成能力，成為牙周再生最理想的種子細(xì)胞。近年來隨著研究的深入，hPDLSCs在骨修復(fù)再生、神經(jīng)損傷修復(fù)等方面有了突破性進(jìn)展[6-7]，與BMSCs比較，避免骨穿帶來的損傷和痛苦，臨床操作方便，使hPDLSCs在組織工程技術(shù)中擁有巨大的運(yùn)用前景。本實(shí)驗(yàn)采用組織塊法分離培養(yǎng)hPDLSCs，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原CD44、CD90、CD105表達(dá)為高度陽性，造血干細(xì)胞表面抗原的CD34、CD45為高度陰性，這表明所培養(yǎng)的細(xì)胞符合成體干細(xì)胞的特性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

HIF-1α是一個對氧分子敏感的復(fù)合體，在正常氧分壓下，HIF-1α亞基被脯氨酰羥化酶(prolylhydroxylase，PHD)羥基化而降解；在低氧條件下，PHD被抑制，HIF-1α與HIF-1β結(jié)合形成復(fù)合體，激活下游近百種靶基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化等活動[8]，而且HIF-1α可以誘導(dǎo)VEGF高表達(dá)，VEGF促進(jìn)新血管形成，進(jìn)而為骨缺損區(qū)輸送大量與成骨相關(guān)的生長因子，增加骨修復(fù)與再生能力[9]。DMOG作為一種小分子酮戊二酸類似物, 通過與內(nèi)源性的2-酮戊二酸競爭從而抑制PHD,穩(wěn)定HIF-1α表達(dá)，已被證實(shí)DMOG具有神經(jīng)保護(hù)、能促進(jìn)缺血疾病的血管再生和促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化作用[10-12]。本實(shí)驗(yàn)給予不同濃度DMOG處理hPDLSCs，探索DMOG對hPDLSCs成骨分化和成血管能力的影響。MTT結(jié)果顯示DMOG對hPDLSCs缺血清損傷具有保護(hù)作用，且10 μmol/L的DMOG作用最顯著。有研究[13]顯示，90%的間充質(zhì)干細(xì)胞在移植體內(nèi)的第1天死亡只有少數(shù)能存活，因此可以認(rèn)為DMOG 可能提高h(yuǎn)PDLSCs在體內(nèi)移植部位的存活率。Western blot檢測結(jié)果顯示，常氧狀態(tài)下，HIF-1α易降解，對照組表達(dá)較低，DMOG處理組明顯增加，表明DMOG 能有效地抑制HIF-1α的降解，使其在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)；VEGF表達(dá)也顯著增加，且具有濃度依賴性，VEGF緩慢持續(xù)釋放被認(rèn)為是新骨血管形成的關(guān)鍵[14]，因此，DMOG能通過提高h(yuǎn)PDLSCs成血管能力間接改善骨修復(fù)能力。間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化始于前體成骨細(xì)胞，進(jìn)而分化為成熟的成骨細(xì)胞，研究[15]顯示，Runx2是間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的關(guān)鍵因子，能調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞向前體成骨細(xì)胞分化過程中所必須的非膠原蛋白(如OCN)，也是骨形成過程中最早和最具特異性的標(biāo)志基因；ALP是成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志物，并參與成骨細(xì)胞的鈣鹽沉積。因此，本實(shí)驗(yàn)通過檢測Runx2、ALP、OCN的表達(dá)來探索hPDLSCs的成骨分化，RT-PCR結(jié)果顯示隨著DMOG濃度的提高h(yuǎn)PDLSCs的成骨分化能力逐漸增加，10 μmol/L時(shí)增加最顯著，但當(dāng)濃度達(dá)到100 μmol/L時(shí)，成骨分化能力明顯被抑制，與ALP染色和茜素紅染色結(jié)果相一致，這可能與DMOG顯著抑制細(xì)胞增殖有關(guān)，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。