不同方法制備富血小板血漿對兔脂肪干細胞增殖和成骨分化能力的影響

胡育瑄，何家才,2

富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)是利用梯度離心原理從自體全血中離心獲得的血小板濃縮物，在特定的物理因素或激活劑條件下能被激活并釋放多種細胞因子，這些細胞因子能夠促進多種細胞的增殖、遷移和分化，并參與新生血管的形成以及骨的再生；PRP被激活后呈凝膠狀，可以為細胞生長提供天然支架，為組織的再生創造良好的微環境。不同的制備方法會影響PRP中血小板以及生長因子的濃度，影響其最終作用效果。脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是來源于脂肪組織的具有多種分化潛能的間充質干細胞。自體ADSCs來源豐富，取材方法簡單易掌握，常作為組織工程技術中的種子細胞。該研究首先分別應用3種方法制備PRP，對比PRP產物中血小板濃度以及血小板回收率的區別；然后將PRP和ADSCs共培養，探討PRP對ADSCs增殖和成骨分化的影響，以及PRP+ADSCs復合材料用于組織工程技術的可行性，為以后的臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1實驗動物與材料健康新西蘭大白兔3只，兔齡4個月，雄性，體質量1.5～2 kg；CD44、CD90(美國BD Pharmingen公司)；CCK-8試劑盒 (江蘇碧云天生物有限公司); 油紅O(美國Sigma公司); 茜素紅染色液(北京百奧萊博科技有限公司); 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)顯色試劑盒、對甲苯胺藍(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine salt，BCIP)、ALP定量試劑盒(南京建成生物工程研究所)； RT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)。

1.2方法

1.2.1PRP的制備與分析 新西蘭大白兔術前臀部肌注速眠新Ⅱ注射液(0.1 ml/kg),其體動反應消失后臀部肌注2%戊巴比妥鈉(1 ml/kg)。抽取適量兔耳中央動脈血，立即注入采血管內，并以1 ∶9的比例加入抗凝劑。

1.2.1.1二次離心法制備PRP 將10 ml全血樣轉移到15 ml離心管，1 000 r/min離心15 min，緩慢吸取上清液及交界面下3 mm紅細胞移至新的離心管內，3 000 r/min離心10 min樣品分為3層，用吸管慢慢棄去3/4的上清液，保留下方的1 ml，輕輕震蕩后得到未激活的PRP。

1.2.1.3Tubex改良法制備PRP 取10 ml全血注入Tubex裝置內，小心擰緊裝置，2 500 r/min離心10 min，擰緊分離裝置后將其垂直倒置裝置，3 000 r/min離心10 min，觀察到血樣分為3層。使用專用注射器由上向下吸取，最下面的1 ml即為PRP。

取上述全血以及3種離心方法制備的PRP各20 μl，加入血小板稀釋液配成400 μl懸液，充分混勻，液體變透明后吸取15 μl 加入血細胞計數池，靜置10 min 后在高倍鏡下進行觀察計數。將得到的結果按照以下公式進行計算，血小板富集系數：血小板富集系數(%)=PRP血小板濃度×PRP體積/(全血血小板濃度×全血血體積)×100%。

1.2.2ADSCs分離培養與鑒定

1.2.2.1ADSCs分離 動物麻醉方法同前。術區局部消毒，無菌條件下，切取兔腹股溝處的脂肪組織，放于含1%雙抗的PBS中。在超凈工作臺內，使用無菌PBS反復沖洗組織塊，在15 ml離心管中使用無菌眼科剪將組織塊剪成小于1 mm的碎塊，加入2倍體積的3 g/L的I型膠原酶， 37 ℃孵育箱內消化，并每隔10 min搖晃一次。消化30 min取出，向離心管內加入等體積的含10%FBS的α-MEM培養液終止消化。200目濾網過濾，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用10%FBS的α-MEM重懸細胞，接種，37 ℃、5% CO2的孵育箱中培養24 h，觀察細胞完全貼壁后換液，以后每3 d換液一次。細胞長至皿底80%，經胰酶消化后傳代培養，取第3代細胞用于實驗。

1.2.2.2流式細胞術鑒定細胞表面抗原 待第3代細胞融合率達80%～90%時，PBS洗2遍，0.25%胰酶消化，離心(1 000 r/min、5 min)，PBS洗2～3遍，棄去上清液；用含3%FBS的PBS重懸，計數，調整細胞密度以1×106個/ml，每管100 μl 分裝至EP管內。分別加入5 μl 的CD44-PE、CD90-FITC和PBS，其中PBS組為陰性對照，室溫條件下，避光孵育1 h；用PBS洗3 遍， 1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加400 μl 的PBS重懸，震蕩均勻，上機檢測。

1.2.2.3成骨分化能力檢測 ① 成骨誘導液配置: 10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，10 μmol/L地塞米松，50 mg/L 維生素C，10%FBS 的α-MEM培養基，100 U/ml 青霉素，100 U/ml鏈霉素；② 待第3代細胞融合率達80%～90%時，0.25%胰酶消化后鋪板，第2天換成骨誘導液，之后每3 d換一次液，培養21 d；③ 茜素紅染色：培養21 d后棄培養液，PBS洗2～3次，4%的多聚甲醛溶液固定10～15 min；棄去固定液，雙蒸水洗3次，每次3min，每孔加1ml的茜素紅染液，室溫下避光染色15～20 min。雙蒸水沖洗多余染色液，加入適量的PBS后在顯微鏡下觀察拍照。

1.2.2.4成脂分化能力檢測 ① 成脂誘導液配置： 0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，10 mg/L胰島素，10 μmol/L地塞米松，0.1 mmol/L 吲哚美辛，10%FBS的α-MEM 培養基，100 μg/ml鏈霉素，100 U/ml青霉素；② 待第3代細胞融合率達80%～90%，0.25%胰酶消化后鋪板，第2天更換成脂誘導液，之后每3 d換液一次，培養21 d；③ 油紅O染色：稱取0.25 g油紅O溶于50 ml異丙醇，加入33 ml雙蒸水震蕩混勻得到油紅O染液。成脂誘導培養也培養21 d后，棄去各組培養液，PBS洗2～3次，4%的多聚甲醛溶液，室溫下固定30 min；棄去固定液，雙蒸水洗3次，每次3 min，加入1 ml的油紅O染液覆蓋皿底，室溫下染色30 min。雙蒸水沖洗多余的油紅O染液，加入適量的PBS后在顯微鏡下觀察染色情況并拍照。

1.2.3PRP對ADSCs細胞增殖能力的影響 CCK-8實驗：① 細胞接種與饑餓處理：取生長狀態良好的第3代細胞，0.25%胰酶消化，以1×103個/孔接種到96孔板，10%FBS培養液培養24 h，更換成無血清培養液培養24 h；② 24 h棄去各孔中原培養液，換成實驗培養液培養： 將上述3種方法制備的RPR按照體積比50%溶于α-MEM 培養液(含10%FBS、100 U/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素)中，經過22 μm濾網過濾后備用，并標記為PRP-2、PRP-3、PRP-Tubex及空白對照組。10%FBS的α-MEM培養液培養的為空白對照組；每組加入對應的100 μl培養液，37 ℃、5% CO2培養箱中培養；③ 分別培養24、48、72 h后進行CCK-8檢測，每孔加入100 μl CCK-8， 37 ℃、5% CO2培養箱孵育4 h后，用酶標儀檢測450 nm處的吸光度(optical density,OD)值，各孔OD值減去調零孔OD值即為實際吸光度。

表1 Real-time PCR 引物序列

1.2.4PRP對ADSCs成骨分化能力的影響 取生長狀態良好的第3代ADSCs，0.25%胰酶消化，調整細胞濃度以2×105個/孔接種于6孔板，用含10%FBS的α-MEM培養液培養至80%～90%融合后更換培養液；實驗分組為：PRP-2組、PRP-3組、PRP-Tubex組、成骨誘導組和空白對照組，其中成骨誘導組使用成骨誘導液培養，空白對照組為使用含10%FBS的α-MEM培養液培養。每3 d換一次液，培養14 d后分別進行以下檢測。

本節主要分析進口Mach數對燃燒流場特性的影響規律. 噴流條件固定, 取值為Majet=1.0, Tjet=300 K, Pjet=0.96 MPa. 發動機進口氣體為氧氣與氮氣質量分數比為0.23∶0.77的混合空氣, 溫度和壓強分別固定為: T∞=754 K, P∞=86 kPa. 進口Mach數取值及其對應的進口處流場參數如表 2所示, 表中Q為來流質量流量, φ為化學當量比.

1.2.4.1茜素紅染色 染色方法同1.2.2.3。

1.2.4.2ALP染色 ① 培養14 d后棄去各組培養液，用PBS洗2～3次，4%的多聚甲醛溶液固定30 min；棄去固定液，雙蒸水漂洗3次，每次3 min; ② ALP顯色液配制：按照ALP顯色試劑盒說明書配制BCIP/NBT染色工作液，充分混勻，避光備用；③ 染色：每孔加入350 μl的染色液覆蓋皿底，室溫避光條件下，染色2 h。使用雙蒸水沖洗2～3次，終止染色，加入適量的PBS后在顯微鏡下觀察染色情況并拍照.

1.2.4.3ALP定量 分別在培養的第3、5、7、14 天進行ALP定量實驗。① 細胞破碎：棄去培養液，PBS洗2～3次，每孔加350 μl 的Triton X-100，裂解30～40 min，待孔內液體變清亮后移出待測；② 顯色：在96孔板內，標準孔每孔依次加入30 μl 的0.02 mg/ml標準液、50 μl的基質液和50 μl的緩沖液，測定孔每孔加入30 μl的待測樣本、50 μl的基質液和50 μl的緩沖液，空白孔依次加入30 μl的雙蒸水、50 μl的基質液和50 μl的緩沖液，混勻，放置于 37 ℃水浴中15 min，每孔加入150 μl的顯色劑；③ 吸光度測量：上酶標儀，測定在520 nm波長處各孔的OD值；④ RT-PCR：培養72 h后終止培養提取細胞總RNA進行RT-PCR檢測。使用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒提取細胞總RNA，使用PrimeScript RT Master Mix試劑盒進行逆轉錄。參照SYBR Premix Ex Tap TMII 說明書進行RT-PCR檢測。目的基因為內參β-actin、ALP、骨成型蛋白質-2(bone morphogenetic protein，BMP-2)、成骨細胞特異性物質骨鈣素(osteocalcin, OCN)和人類相關轉錄基因-2(Runt-related transcription factor 2, Runx2)。所有引物由大連TaKaRa公司設計合成，見表1。RT-PCR 的反應條件是：95 ℃、30 s，95 ℃、15 s，60 ℃、34 s。

2 結果

2.1血小板計數和血小板回收率3種方法制取的PRP中血小板計數結果分別如圖1所示：傳統二次離心法、三次離心法和Tubex法制備PRP的血小板計數值分別為(1 318.9±254.8)×109/L、(1 886.0±364.4)×109/L、(2 257.9±436.2)×109/L，血小板采集率分別為50.12%、71.67%、 85.80%，Tubex法制備的PRP中血小板含量要顯著高于其余兩種方法(F=46.44，P<0.05 )。

圖1 不同制備方法制備的PRP和全血中的血小板計數

1：空白對照組；2：傳統二次離心法；3：三次離心法；4：Tubex法；與空白對照組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.2ADSCs分離與鑒定本實驗通過酶消化組織塊法分離培養ADSCs，通過流式細胞儀檢測細胞表面特異性標志物結果如圖2A、2B所示：該細胞高表達間充質干細胞特異性表面標志物CD44和CD90，陽性率分別為99.4%和99.1%。

圖2 流式細胞儀分析ADSCs細胞表面抗原

圖3 ADSCs形態 SP×400

2.3ADSCs形態使用酶消化組織塊法分離出的細胞，鏡下觀察：細胞界限清楚，胞質豐富，核偏大，形似成纖維細胞(圖3A)。將細胞向成脂和成骨方向誘導培養21 d，油紅O染色顯示：鏡下見紅色小脂滴形成(圖3B)；茜素紅染色顯示：鏡下可觀察到紅褐色的鈣結節的形成(圖3C)。

2.4PRP對ADSCs細胞增殖能力的影響將3種方法制備的PRP與ADSCs共培養24、48、72 h后，CCK-8試劑盒檢測結果見圖4。含有PRP培養的細胞OD值均明顯高于空白對照組(P<0.05)，PRP-Tubex組的細胞OD值在48 h和72 h顯著高于PRP-2和PRP-3組，差異具有統計學意義(P<0.05)，而PRP-2和PRP-3組的細胞OD值在48 h和72 h差異無統計學意義，因此與其他組比較，PRP-Tubex組能顯著提高細胞增殖能力。

2.5PRP對ADSCs成骨分化能力的影響培養14 d后，茜素紅染色結果顯示：空白對照組無明顯鈣結節產生，成骨誘導組有明顯的紅褐色鈣結節，含PRP的處理組紅褐色鈣結節的量較成骨誘導組顯著增加。培養14 d后，ALP染色結果顯示：空白對照組幾乎未染色，成骨誘導組以及3個PRP處理組的染色程度較深，其中成骨誘導組的染色程度明顯低于PRP 3個處理組。見圖5。

圖4 不同處理后ADSCs增殖率圖

與空白對照組比較：#P<0.05；與PRP-Tubex組比較：*P<0.05

ALP定量：在培養的3 d，各組細胞的ALP水平差異無統計學意義，在培養5 d后空白對照組的ALP活性最低(P<0.05)。在培養的第14天，PRP-Tubex組的ALP活性要顯著高于空白對照組(P<0.05)，各種處理后ADSCs的ALP活性大小為：PRP-Tubex組>PRP-3組>PRP-2組>成骨誘導組>空白對照組。見圖6。

圖5 ADSCs茜素紅染色和ALP染色結果 SP×400

A：空白對照組；B：成骨誘導組；C：PRP-2組；D：PRP-3組；E：PRP-Tubex；1：茜素紅染色；2：ALP染色

圖6 ALP 定量結果

圖7 RT- PCR檢測相關基因表達

與空白對照組比較：#P<0.05；與成骨誘導組比較：*P<0.05

RT-PCR檢測結果顯示(圖7)，在培養的3 d后，各個PRP處理組的成骨分化標志基因Runx2、OCN、 ALP、BMP-2的的表達均顯著高于空白對照組和礦化誘導組(P<0.05)。

3 討論

自從PRP首次被發現可以在體外促進平滑肌細胞的有絲分裂之后[1]，PRP內部豐富的生長因子和細胞因子逐漸被科學家揭開面紗[2-7]，由于這些細胞因子能夠促進多種細胞的生長和分化，有助于創傷的愈合和修復，人們更期待于將之運用于臨床。

PRP制備的基本原理是利用全血中不同組分之間沉降系數的差異，通過使用梯度離心的原理分離出有效成分。在離心的過程中，離心力、離心時間以及離心次數等的差異均會對最終產品的成分和性能產生影響。采用何種方法使所得的PRP中血小板和生長因子的濃度和活性達到最大仍需探索。

本研究使用傳統的二次離心法制備的PRP中血小板的濃度約為全血的5倍。采用三次離心法制備PRP中的血小板數目更多，采集率更高約為二次法的1.4倍；而使用Tubex裝置制備法的血小板采集率最高，達到了85.8%，為傳統二次離心法的1.7倍。為了最大限度的從全血中提取血小板，必須避免其在提取過程中的損失。而二次離心法和三次離心法均需經歷多次離心和轉移，這些過程造成的損失不可避免；其次，在制備PRP過程中丟棄的紅細胞表面可能會黏附血小板等物質，也會造成血小板采集率的降低。Tubex裝置屬于密閉的，能避免樣品轉移所造成的損失，也能減少污染率。

在本實驗中顯示3種方法制備的PRP在體外激活后均能促進ADSCs的增殖。另外，PRP處理組細胞的成骨標志基因ALP、BMP-2、OCN、Runx2等的表達水平明顯增高，ALP活性也明顯增加，表明提高了ADSCs向成骨分化的潛能。PRP激活后可以釋放血小板源性生長因子、胰島素樣生長因子、轉化生長因子-β、血管內皮細胞生長因子、表皮生長因子等[7-8]。研究[9]顯示20 ng/ml的血小板衍生生長因子-BB可以上調ADSCs成骨標志基因的表達，促進ADSCs的成骨分化。

使用傳統的離心法制備PRP，制備過程中血樣經多次離心和轉移，過程中的某些刺激會提前激活PRP，導致生長因子釋放，使活化的終產物中生長因子濃度偏低。特定的生長因子其濃度需要保持在穩定的水平，偏低或偏高都可能會對細胞的有絲分裂及分化造成影響[10]。所以，如何精準調控生長因子濃度對其最終效果起到了關鍵作用，是目前研究的難點。

在制備PRP過程中，激活劑、抗凝劑或制備溫度的差異均會對血小板的采集率和生長因子的釋放造成影響[11]。因此選擇合適的PRP的制備方法、調控PRP中生長因子的種類、濃度以及其釋放是其優化應用的主要問題。另外，還應考慮到不同個體全血中的成分及其含量的不同。本實驗采用同一動物的全血樣本進行3種不同制備方法，同時抗凝血劑以及激活方法及溫度均一致，避免了這些可能對實驗造成誤差的因素[12]。不同種類的細胞因子對細胞的生命活動可以發揮協同作用，但其濃度會對作用效果產生差異。本實驗只粗略設定了PRP的濃度，而關于生長因子的種類和濃度和其之間的作用機制仍需進一步探討。