吳茱萸次堿對大鼠急性腎損傷氧化應激的影響及機制研究

王春華，俞百元，余又新，方林森，徐慶連，梁朝朝

急性腎損傷發生和進展中，氧化應激損傷起著重要的作用，通過抑制氧自由基產生及氧化應激反應可有效減輕缺血再灌注腎損傷。吳茱萸次堿(rutaecarpin，Ru)是中藥吳茱萸的主要藥理活性成分，研究[1-2]已證實其具有廣泛的生物學活性，對于缺血再灌注(ischemia reperfusion injury，IRI)腎損傷的作用鮮有報道。該研究通過動物實驗探討吳茱萸次堿對大鼠急性腎損傷氧化應激的作用和可能機制。

1 材料與方法

1.1動物分組及模型制作100只SPF級成年雄性SD大鼠，體質量(250±10)g，購自安徽醫科大學動物實驗中心。隨機分為5組：① 假手術組(Sham組)：給予大鼠麻醉、置管、打開腹腔，但是不造成腎缺血；② 腎缺血再灌注組(IRI組)：給予手術造成腎缺血再灌注損傷；③ 生理鹽水組(NS組)：給予生理鹽水預處理；④ 低劑量組(Ru-30組)：低劑量吳茱萸次堿預處理；⑤ 高劑量組(Ru-60組)：高劑量吳茱萸次堿預處理。吳茱萸次堿在使用前配制，用生理鹽水作為稀釋液，并通過過濾器進行過濾，于腎缺血前2 h經尾靜脈注射給藥或生理鹽水進行預處理。NS組：手術前生理鹽水10 ml/kg尾靜脈微量泵滴注或靜推；Ru-30組：手術前30 mg/kg的吳茱萸次堿(3 mg/ml)。按10 ml/kg尾靜脈微量泵滴注給藥；Ru-60組：手術前60 mg/kg的吳茱萸次堿按10 ml/kg尾靜脈微量泵滴注給藥。用4% 氯胺酮50 mg/kg腹腔注射，麻醉達成后，動物仰臥于恒溫手術臺。手術中根據麻醉深度的需要可追加首劑量的20%～25%。行尾靜脈置管，接微量泵持續輸注生理鹽水或靜推生理鹽水或不同量的吳茱萸次堿進行預處理。注藥或生理鹽水2 h后，于大鼠腹部作正中切口打開腹腔，暴露并游離出腎臟，注意保護好輸尿管免受損傷。采用無創動脈夾夾閉雙側腎的腎蒂，形成雙側腎缺血的狀態，此時可用肉眼觀察到腎臟的顏色由血紅色快速轉變為蒼白色，這一結果說明腎缺血模型造模成功。然后縫合切口封閉腹腔。45 min后，再次于原處打開大鼠腹腔，小心處理使雙側腎蒂暴露出來，打開動脈夾，恢復腎臟血流的再灌注，此時可用肉眼觀察到腎臟的顏色由蒼白色快速轉變回血紅色，說明缺血后再灌注成功。假手術組在大鼠麻醉以及尾靜脈置管后不夾閉雙側腎蒂，其他處理與動物模型組和給藥組相同。手術后關閉腹腔讓其自然蘇醒，分籠飼養。

1.2標本采集于術后24 h后采取同樣麻醉方法在麻醉下經頸椎脫臼處死全部受試大鼠。在處死大鼠前每只大鼠取血3 ml，均為尾靜脈采血，3 000 r/min離心10 min后取血清放入-70 ℃低溫冰箱中保存待測。處死大鼠后取兩腎臟儲存，備用。測定腎組織中丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及血清中一氧化氮(nitric oxide，NO)、肌酐(creatinine，Cr)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平。

表1 吳茱萸次堿對腎缺血再灌注損傷大鼠各指標的影響

與Sham組比較：*P<0.05，**P<0.01；與IRI組比較：#P<0.05；與NS組比較：▽P<0.05

2 結果

2.1各組受試大鼠腎組織勻漿中MDA和SOD含量檢測腎缺血再灌注損傷時，腎組織中MDA含量增加，與腎功能的改變相一致，同時，腎組織中SOD活力下降，下降的程度與腎功能惡化的程度也相一致(P<0.05)。吳茱萸次堿處理后上述指標顯著改善(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組腎組織勻漿MDA、SOD含量

2.2受試大鼠血清中各指標的檢測與Sham組比較， IRI組和NS組SD 大鼠的血BUN、Cr量顯著提高(P<0.01)，提示腎功能嚴重受損。用 30 mg/kg 和60 mg/kg吳茱萸次堿處理后的大鼠其血漿中BUN、Cr 的水平與IRI組和NS組相比明顯降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性。與Sham組比較，IRI組、NS組受試大鼠血清的NO的量顯著升高，而用吳茱萸次堿處理后，受試大鼠在腎缺血再灌注的過程中血清中NO量明顯降低，且呈劑量依賴性，具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

3 討論

腎缺血再灌注損傷的發生機制尚未完全闡明，是由多因素、多途徑、多方面所介導的一個動態發展過程。其中氧化應激在急性腎損傷病程進展中具有重要地位。減輕氧化應激反應是治療急性腎損傷的重要手段，中藥吳茱萸次堿是一種天然生物堿，屬于喹唑啉咔啉類，是吳茱萸的主要成分之一，基礎研究及臨床上均顯示良好的抗炎和免疫調節作用[3]。研究[4-5]顯示其具有廣泛的藥理學活性，包括抑制炎癥介質、免疫調節、抑制氧自由基釋放，抑制黏附分子的表達等。本研究通過建立大鼠急性腎損傷模型，從氧化應激反應與腎功能改變方面探討吳茱萸次堿對急性缺血再灌注腎損傷的作用及機制。

本研究中，腎臟在缺血再灌注后，吳茱萸次堿各濃度組、IRI組與Sham組比較，血清BUN、Cr含量均升高，說明缺血再灌注過程中大鼠腎組織結構和功能嚴重受損。吳茱萸次堿各濃度組血清中BUN、Cr的含量顯著降低，說明吳茱萸次堿預處理能夠保護腎組織結構和功能，并且結果顯示隨著劑量的升高呈明顯的緩解現象。氧自由基的大量形成以及脂質過氧化的過量增加是在腎缺血再灌注過程中導致腎細胞損傷的主要原因之一。氧自由基對所有的生物分子具有氧化損傷作用，尤其是脂質過氧化損傷細胞最為嚴重。MDA是脂質過氧化物反應的最終代謝產物。脂質過氧化在腎缺血再灌注時活躍， SOD活性降低，MDA生成量增高，則SOD活力的高低間接反映了機體消除氧自由基的能力，MDA含量的高低間接反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度[6-11]。本研究結果說明在吳茱萸次堿的干預下，腎缺血再灌注的過程中腎組織的氧自由基的生成明顯減少，吳茱萸次堿能抑制由此激發的脂質過氧化反應，增加氧自由基的清除作用，從而減少氧自由基生成，減輕缺血再灌注后的腎臟損傷，因此，抗氧化應激反應可能是吳茱萸次堿對腎缺血再灌注損傷保護作用的可能機制之一。

NO是一個多功能調節因子，同時又是一個自由基，在正常生理條件下，NO的直接作用則是對臟器的保護作用，病理情況下其間接作用則是其毒性作用[12-14]。在腎缺血再灌注損傷的過程中，一氧化氮合成酶(nitric oxide synthetase，NOS)被激活，使得iNOS的表達上調，腎臟組織中產生大量的NO從而對腎臟形成直接的或間接的損傷。研究[15-19]表明，在腎缺血再灌注損傷的過程中，NO是介導腎小球損傷的主要因素之一。本研究結果中吳茱萸次堿預處理大鼠血清NO含量減低，并呈劑量依賴性關系，說明吳茱萸次堿對腎缺血再灌注損傷的保護機制可能是抑制NOS、減少NO的生成而發揮作用的。

本實驗提示茱萸次堿對腎缺血再灌注損傷具有保護作用,抑制NOS、減少NO的生成及抗氧化作用可能是其潛在機制。