乳源六肽增加人卵巢癌細胞對順鉑的敏感性

徐 恰，阮 昕，汪慎燚，席 浩，韋文美,2，秦宜德

卵巢癌致死率高，早期癥狀不典型，組織類型和良惡性難以診斷，因此女性卵巢癌患者的治愈率較低[1-3]。以鉑類和紫杉醇為主的臨床化療治療藥物耐藥性的產生[4]，抑制了患者對化療藥物的敏感性，治療效果達不到理想效果。所以，提高卵巢癌細胞對化療藥物的敏感性，防止耐藥性的發生，增強療效對卵巢癌治療具有重要意義。文獻[5-6]表明，除修復交叉互補基因1(excision repair cross complementing1，ERCC1)表達量多少與卵巢癌耐藥性有關聯，其過表達可降低鉑類化療藥物的治療效果，ERCC1在人卵巢癌耐藥細胞株COC1/DDP中的表達量較高。乳源六肽是一組來源于牛乳β-酪蛋白的短肽，其氨基酸序列為Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn。前期研究[7-11]表明，PGPIPN可以抑制人卵巢癌細胞SKOV3和SKOV3/DDP的生長和增殖，但效果不及目前正在使用的抗癌藥DDP和紫杉醇等。該研究通過不同濃度的PGPIPN聯合DDP，研究對人卵巢癌敏感細胞株COC1和耐藥細胞株COC1/DDP增殖和凋亡的影響，并討論其可能的機制，為開發治療卵巢癌的新方案和治療新藥提供基礎。

1 材料與方法

1.1材料人卵巢癌敏感細胞株COC1和耐藥細胞株COC1/DDP購自中科院細胞所的細胞庫；RPMI-1640(美國Gibico公司)；PGPIPN(上海楚肽生物科技有限公司)；胎牛血清(浙江天杭生物技術公司)；順鉑注射液(山東齊魯制藥有限公司)；流式凋亡試劑盒(上海貝博公司)；CCK8(江蘇碧云天生物技術有限公司)；β-actin鼠抗人抗體(北京中衫金橋生物技術有限公司)；ERCC1兔抗人抗體(美國Abcam公司)；Reverse Trsnscription System(日本TaKaRa公司)；DMSO(北京Solarbio科技有限公司)；TRIzol(美國Thermo Fisher公司)。

1.2方法

1.2.1卵巢癌細胞株的培養 細胞的培養均用RPMI-1640培養基(含雙抗)，10%胎牛血清，培養在37 ℃、5% CO2的培養箱中。在維持COC1/DDP細胞良好生長的前提下，逐步用0.1～0.6 μg/ml的DDP進行刺激。

1.2.2CCK8法測定DDP的半數抑制濃度(IC50) 取對數生長期細胞, 制成細胞懸液, 接種至96孔板, 37 ℃、5% CO2條件下培養過夜, 每孔加入不同濃度的DDP繼續培養24、48、72 h。每孔加入10 μl CCK8溶液繼續在培養箱內孵育1 h。用酶聯免疫檢測儀在450 nm處測定各孔吸光度 (optical density, OD) 值。實驗重復3次。根據各組中各孔OD平均值, 計算細胞增殖抑制率和IC50值。

1.2.3細胞生長增殖的測定 CCK8法測定細胞的成活，檢查藥物對卵巢癌細胞增殖的抑制。細胞培養實驗分為陰性對照組、DDP組、PGPIPN組、DDP和低劑量肽聯合組、DDP和中劑量肽聯合組、DDP和高劑量肽聯合組等6組，分別給與生理鹽水、1×10-4g/L PGPIPN、DDP(IC50)、DDP(IC50)+1×10-6g/L PGPIPN、DDP (IC50)+1×10-4g/L PGPIPN、DDP(IC50)+1×10-2g/L PGPIPN干預。將COC1、COC1/DDP以適宜的細胞密度種于96孔板中，每孔100 μl，細胞培養箱中培育過夜。次日，細胞生長良好，棄培養基，每孔加入事先配好濃度的藥物100 μl, 以等量完全培養基和相同濃度DDP組作為空白對照組和陽性對照組，每組各設置6個復孔，于培養箱中分別培育24、48、72 h。待到作用時間，每孔10 μl CCK8加入到每孔中，培養箱中孵育4 h，將酶標儀波長調整為450 nm，測定96孔板的OD值。細胞存活率(%)=(OD實驗組/OD空白對照組)×100%。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 將COC1、COC1/DDP分別種于兩個6孔板中，加不同濃度藥物，培養48 h。收集細胞，1 000 r/min離心5 min, PBS潤洗3次。每管加入300 μl Binding Buffer和4 μl Annexin V-FITC懸浮細胞, 4 ℃避光孵育15 min后加入7.5 μl PI, 2～8 ℃避光孵育5 min后立即在流式細胞儀上進行檢測, 結果用Flowjo 7.6.1軟件進行分析。

1.2.5RT-PCR檢測ERCC1基因mRNA的表達 用Primer-Bank檢索引物的序列，利用Primer 5.0軟件設計β-actin，ERCC1的引物序列，送至上海生工生物公司合成。使用TRIzol試劑提取細胞RNA,用Reverse Trsnscription System試劑盒逆轉錄為cDNA,加入引物PCR擴增。使用TRIzol試劑提取細胞RNA,用Reverse Trsnscription System試劑盒逆轉錄為cDNA,加入引物PCR擴增。擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采集圖像進行光密度掃描。引物序列見表1。

表1 β-actin、ERCC1引物序列、片段大小和退火溫度

1.2.6Western blot檢測 將COC1、COC1/DDP分別用不同濃度的藥物(每個濃度藥物設置3個復孔)刺激48 h后，BCA法對各組細胞蛋白進行定量10% SDS-PAGE凝膠電泳，250 mA、75 min轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入ERCC1、β-actin一抗4 ℃搖床過夜，加入二抗，室溫孵育2 h，ECL發光顯影。

2 結果

2.1聯合用藥對卵巢癌細胞增殖能力的影響根據從CCK8實驗和GraphyPad Prism 5.0軟件分析，經DDP作用后，COC1細胞的IC50值在24、48、72 h分別是(6.79×10-3±2.632)、(7.73×10-3±3.148)、(6.87×10-3±3.244 )g/L，而COC1/DDP細胞的IC50值在24、48、72 h分別是(15.37×10-3±4.873)、(17.82×10-3±5.019)、(16.51×10-3±4.639)g/L。

從聯合用藥的結果看，PGPIPN能顯著促進DDP對COC1、COC1/DDP的增殖抑制，見圖1。聯合用藥能顯著提高卵巢癌細胞對DDP的敏感性，而且對PGPIPN具有計量依賴性。卵巢癌耐藥細胞株COC1/DDP的增敏效果明顯高于卵巢癌敏感細胞株COC1，與DDP組比較，差異有統計學意義，見圖1。

2.2聯合用藥對卵巢癌細胞細胞凋亡的影響由CCK8結果可知，藥物作用48 h對細胞抑制效果最佳，實驗均選取48 h作為作用時間，用流式細胞儀進行凋亡檢測，COC1組其DDP抑制細胞增殖的平均IC50值在48 h為(7.73×10-3±3.148) g/L，COC1/DDP組其DDP抑制細胞增殖的平均IC50值在48 h為(17.82×10-3±5.019) g/L。

結果可見，PGPIPN能顯著促進DDP誘導COC1、COC1/DDP細胞凋亡，見圖2。聯合用藥能顯著提高卵巢癌細胞對DDP的敏感性， PGPIPN具有計量依賴性。卵巢癌耐藥細胞株COC1/DDP的增敏效果明顯高于卵巢癌DDP敏感細胞株COC1，與DDP組比較，差異有統計學意義 (FCOC1=104.491,P<0.05；FCOC1/DDP=375.810，P<0.05)，見圖2。

圖1 DDP聯合不同濃度PGPIPN對卵巢癌細胞株COC1、COC1/DDP增殖的影響

A：COC1;B：COC1/DDP;1:陰性對照組;2:DDP組;3:PGPIPN組;4:DDP和低劑量肽聯合組;5:DDP和中劑量肽聯合組;6:DDP和高劑量肽聯合組;與DDP組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖2 DDP聯合不同濃度PGPIPN對COC1、COC1/DDP凋亡的影響

A：COC1凋亡圖；B:COC1/DDP凋亡圖；1：陰性對照組；2：DDP組；3：PGPIPN組；4：DDP和低劑量肽聯合組；5：DDP和中劑量肽聯合組；6：DDP和高劑量肽聯合組

2.3RT-PCR檢測相關基因mRNA表達的變化由實驗結果(圖3)可知，耐藥株COC1/DDP細胞ERCC1表達量比敏感株COC1細胞的高。同DDP組比較，聯合用藥組ERCC1的mRNA水平降低，作用效果隨著PGPIPN用藥濃度的增加而增強(FCOC1=279.601、FCOC1/DDP=136.033，P<0.05，P<0.01)。PGPIPN對ERCC1的mRNA抑制效果，卵巢癌耐藥細胞株COC1/DDP明顯高于卵巢癌DDP敏感細胞株COC1(只在高濃度的PGPIPN才顯著降低mRNA水平)。

圖3 RT-PCR檢測COC1、COC1/DDP相關基因mRNA表達的變化

A：COC1的ERCC1基因RT-PCR的電泳圖; B：COC1/DDP的ERCC1基因RT-PCR的電泳圖; C: 基因ERCC1表達的mRNA相對定量統計圖；M: Marker;1:陰性對照組; 2:DDP組;3:PGPIPN組;4:DDP和低劑量肽聯合組;5:DDP和中劑量肽聯合組;6:DDP和高劑量肽聯合組;與DDP組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.4Westernblot檢測相關蛋白表達的變化DDP聯合不同濃度PGPIPN作用于COC1/DDP和COC1細胞后，ERCC1蛋白明顯降低，見圖4。同DDP組比較，聯合用藥下，耐藥細胞株COC1/DDP的ERCC1水平顯著降低，作用效果隨著PGPIPN用藥濃度的增加而增強(FCOC1=73.269，P<0.05，P<0.01)；而對敏感細胞株COC1，在高濃度的PGPIPN下也能顯著降低ERCC1的水平(FCOC1/DDP=97.431,P<0.05)。從結果看，PGPIPN對ERCC1的抑制，卵巢癌耐藥細胞株COC1/DDP明顯高于敏感細胞株COC1。PGPIPN對ERCC1蛋白的抑制規律與抑制該基因mRNA相一致。

圖4 Western blot檢測COC1和COC1/DDP相關蛋白表達的變化

A：COC1的ERCC1蛋白的Western blot的電泳圖; B：COC1/DDP的ERCC1蛋白的Western blot的電泳圖; C: ERCC1蛋白相對定量統計圖，1:陰性對照組;2:DDP組;3:PGPIPN組;4:DDP和低劑量肽聯合組;5:DDP和中劑量肽聯合組;6:DDP和高劑量肽聯合組;與DDP組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

卵巢惡性腫瘤在臨床上的主要醫治措施是早發現和早期切除。目前的治療難題是卵巢癌較易轉移至機體的其他部位，患者手術后容易再次病發，因而，如何控制復發和轉移是卵巢癌治療的熱點。加上患者化療耐藥的影響，進一步降低了卵巢癌治愈率。鉑類如順鉑是治療卵巢癌常用的化療藥物，但是很多患者出現了耐藥的現象。因此，如若能摸索出卵巢癌化療耐藥的分子機制，提高化療敏感性和逆轉耐藥性，對其治療非常有意義。

近年來有很多關于ERCC1與卵巢癌耐藥直接關系的研究。研究[12-14]已表明，接受過順鉑化療藥物的患者中，ERCC1呈高劑量表達。所以，若能干擾ERCC1基因的表達，便能實現增加卵巢癌對化療藥物的敏感性，達到治療卵巢癌治愈的目的。ERCC1的高表達可以修復癌細胞中受損傷的DNA分子，增加存活的癌細胞，從而產生耐藥。PGPIPN能顯著促進腹腔巨噬細胞吞噬活性和紅細胞免疫，前期研究顯示PGPIPN能通過某些信號傳導途徑誘導腫瘤細胞凋亡，提高卵巢癌細胞對DDP的敏感性?？赡艿臋C制是抑制抑制由順鉑等引起的卵巢癌細胞抗凋亡蛋白過表達，增加腫瘤細胞對DDP的敏感性。

PGPIPN作為一種抗癌活性肽，副作用低，對正常人體細胞幾乎無損傷，在未來的臨床應用中將具有廣闊的應用前景。