慢性不可預見性溫和應激對大鼠海馬星形膠質細胞凋亡的影響

金齊穎，吳紅芳，張園園，馬原源，鄧春穎，劉 昊

目前，全球抑郁癥患者約有三億五千萬，是導致自殺、殘疾和疾病負擔的重要原因[1]，其發病機制尚未完全明確。海馬是參與學習、記憶及情緒調節的重要邊緣系統腦區，其改變在各種應激疾病中起到關鍵作用。研究[2-3]顯示，抑郁癥大鼠和抑郁癥患者海馬部位均存在明顯的萎縮。在中樞神經系統中，星形膠質細胞數量最多，人們認識到其作用不僅僅是營養、支持等輔助作用，還參與腦的高級功能活動，是中樞神經系統必不可少的組成部分[4]。膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)能夠用來特異性標記成熟的星形膠質細胞，被廣泛應用于抑郁癥發病機制的研究中[5]。研究[6]表明抑郁大鼠海馬神經元存在凋亡，然而，海馬星形膠質細胞是否存在凋亡現象，目前尚未見報道。該實驗建立慢性不可預見性溫和應激(chronic unpredicted mild stress，CUMS)模型，檢測海馬星形膠質細胞是否存在凋亡，探究抑郁癥發病過程中海馬體積異常的原因。

1 材料

1.1實驗動物成年雄性SD大鼠90只，清潔級，體質量180～200 g，華北理工大學實驗動物中心提供。適應性飼養1周后用于實驗。飼養條件：22～25 ℃，3～5只每籠，晝夜節律(12 h/12 h)，自由飲水進食。

1.2主要試劑GFAP、小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體、驢抗羊熒光二抗、驢抗兔熒光二抗、兔抗小鼠單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司；兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteine-containing aspartate-specific proteases-3，Caspase-3)多克隆抗體、兔抗Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)多克隆抗體、兔抗B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymmpoma/leukemia-2，Bcl-2)多克隆抗體、羊抗兔單克隆抗體購自美國ProteinTech公司；Western blot和免疫熒光相關試劑購自武漢博士德生物有限公司。

1.3方法

1.3.1動物分組及模型建立 按照隨機數字表法將90只SD大鼠隨機分為對照組(45只)和模型組(45只)，模型制備成功后又隨機分為1、7、14 d 3個亞組(每組15只)。模型組給予CUMS。應激包括11種：4 ℃冰水游泳5 min，鼠籠45°傾斜24 h，禁食24 h，42 ℃熱水游泳5 min，束縛2 h，潮濕墊料24 h，夾尾90 s，禁水24 h，雙耳電擊5 s兩次(0.8 mA)，鼠籠搖動15 min，持續光照24 h。在28 d內每天隨機給予一種刺激，同種刺激不連續出現。對照組大鼠除每天抓取一次外，不做任何特殊處理。在應激結束后，分別于1、7、14 d處死大鼠。

1.3.2行為學檢測

1.3.2.1糖水偏好實驗 實驗前大鼠進行禁食水24 h，每個鼠籠放置兩個完全相同的水瓶，純凈水和1%的蔗糖水各200 ml，雙瓶共飲，實驗前確保飲水瓶不滴漏。測量1 h內純凈水和蔗糖水的消耗量。計算糖水偏好率：糖水偏好率(%)=糖水消耗量/總液體消耗量×100%。

1.3.2.2曠場實驗 造模結束后，在每天相同的時間段將大鼠放在長120 cm、寬120 cm、高35 cm的場所的中心方格中，運用鼠博士視頻分析系統記錄，包括5 min內大鼠行走總路程，中央活動時間，站立次數，修飾行為等。

1.3.2.3Morris水迷宮實驗 連續3 d記錄大鼠在120 s內找到水下平臺需要的時間，即逃避潛伏期(escape latent，EL)，最后用Morris水迷宮軟件對結果進行分析。

1.3.3Western blot法檢測海馬Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達 將大鼠麻醉后斷頭取腦，冰上快速分離海馬，提取組織總蛋白。BCA定量后按照30 μg蛋白量上樣，進行12%SDS-PAGE電泳，PVDF膜電轉印，脫脂奶粉封閉，一抗兔抗Caspase-3多克隆抗體(1 ∶500)、兔抗Bax多克隆抗體(1 ∶500)，兔抗Bcl-2多克隆抗體(1 ∶500)及小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(1 ∶5 000),4 ℃孵育過夜，二抗羊抗兔IgG(1 ∶5 000)室溫孵育1 h，ECL顯色。同樣的方法進行內參β-actin的Western blot分析。以目的條帶與內參的光密度比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.3.4免疫熒光雙標 大鼠麻醉后，進行灌流固定，取腦組織，常規制作石蠟切片。切片脫蠟至水，抗原修復后，免疫組化筆劃圈，0.4% PBS-Triton室溫孵育15 min，驢血清封閉1 h，加入一抗(兔抗Caspase-3多克隆抗體與羊抗GFAP混合液、或兔抗Bax多克隆抗體與羊抗GFAP一抗混合液、或兔抗Bcl-2多克隆抗體與羊抗GFAP一抗混合液)，4 ℃孵育過夜，陰性對照用PBS代替一抗，次日室溫孵育45 min，加入Alexa Fluor594標記的驢抗兔二抗和Alexa Fluor488標記的驢抗羊二抗混合液，封片劑封片，放置于避光盒內，激光共聚焦顯微鏡觀察攝片。

2 結果

2.1糖水偏好實驗對照組與模型組的普通水消耗量兩組差異無統計學意義(P>0.05)。對照組和模型組大鼠糖水偏好率兩組差異有統計學意義(P<0.01)。模型組大鼠糖水消耗量和糖水偏好率低于對照組。見表1。

表1 兩組大鼠糖水偏好結果

與對照組比較：**P<0.01

圖1 兩組大鼠曠場實驗和Morris水迷宮實驗軌跡圖

A：對照組曠場實驗軌跡圖；B：模型組曠場實驗軌跡圖；C：對照組Morris水迷宮實驗軌跡圖；D：模型組Morris水迷宮實驗軌跡圖

表2 兩組大鼠曠場實驗和 Morris 水迷宮實驗結果

與對照組比較：**P<0.01

2.2曠場實驗和水迷宮實驗模型組大鼠行走總路程、中央活動時間、直立次數、和修飾行為次數均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。模型組大鼠平均逃避潛伏期較對照組明顯延長，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2、圖1。

2.3各組大鼠海馬Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達情況根據條帶分析顯示，與對照組比較，CUMS后1、7、14 d大鼠海馬Caspase-3、Bax蛋白表達水平均升高(P<0.05)，7 d時升高最明顯。與對照組比較，CUMS后1、7、14 d大鼠海馬Bcl-2蛋白表達水平降低(P<0.05)。模型組大鼠Bax/Bcl-2較對照組升高(P<0.05)。結果見圖2、表3。

圖2 Western blot法檢測海馬Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達

組別BaxBcl-2Caspase-3Bax/Bcl-2對照0.63±0.121.05±0.150.55±0.120.60±0.04CUMS 1 d0.95±0.17?1.02±0.16?0.99±0.22?0.93±0.03? 7 d1.38±0.30?0.89±0.16?1.59±0.40?1.54±0.99? 14 d0.92±0.25?0.45±0.07?0.86±0.15?2.07±0.42?F值13.6927.3822.1965.01

與對照組比較：*P<0.05

2.4免疫熒光雙標GFAP為Alexa Fluor488激發的綠色熒光，Bax、Bcl-2和Caspase-3均為Alexa Fluor594激發的紅色熒光，圖像融合后可見黃色熒光，表明GFAP 和Bax、GFAP和Bcl-2、GFAP和 Caspase-3均有共定位表達。CUMS后7 d模型組大鼠海馬Bax陽性細胞及熒光融合均多于對照組，見圖3。CUMS后7 d模型組大鼠海馬Bcl-2陽性細胞及熒光融合均少于對照組，見圖4。CUMS后7 d模型組大鼠海馬Caspase-3陽性細胞及熒光融合均多于對照組，見圖5。

3 討論

抑郁癥是一種常見的神經精神疾病，主要表現為持續的情緒低落、無價值感、認知功能的改變等，嚴重時常伴有自殺傾向[7]，目前病因及發病機制尚未完全明確。建立正確的抑郁癥動物模型是抑郁癥實驗研究成功的關鍵。相關資料表明，大鼠的壽命約為2～3年，大鼠經歷7 d約為人類的1年[8]，通過給予模型組大鼠CUMS刺激，可以模擬人們現實生活中經受的慢性、間斷性、低強度的刺激后出現的癥狀[9]。本實驗行為學檢測結果表明，模型組大鼠糖水消耗量和糖水偏好百分比明顯降低，曠場實驗得分明顯減低，逃避潛伏期明顯延長，提示經過CUMS刺激后，大鼠表現出明顯的快感缺失、自主探究行為減少、探索能力下降、空間學習記憶能力減退，成功地模擬了抑郁癥患者的主要癥狀。本實驗選取CUMS后1、7、14 d模擬人類患抑郁癥后1、2、3年后凋亡相關因子的變化，為抑郁癥的治療提供新的理論依據。

圖3 免疫熒光雙標法檢測大鼠海馬組織中Bax的表達 ×400

圖4 免疫熒光雙標法檢測大鼠海馬組織中Bcl-2的表達 ×400

圖5 免疫熒光雙標法檢測大鼠海馬組織中Caspase-3的表達 ×400

本課題組前期對抑郁癥大鼠海馬體積縮小的原因進行研究[10-12]顯示，海馬神經元存在明顯的凋亡、自噬及神經可塑性等改變。星形膠質細胞廣泛分布于中樞神經系統中，在神經元營養支持、神經組織的修復及再生、血腦屏障的形成及維持內環境的穩定、神經遞質的攝取、突觸的傳遞、神經免疫等方面起著十分重要的作用[13-14]。GFAP是特異性表達于星形膠質細胞的一種III型中間絲蛋白，分子量為50～52 ku，GFAP基因位于17號染色體上(17q21)，其表達水平與星形膠質細胞活化呈正比，是星形膠質細胞公認的標志性蛋白，可能與其特異性的末端氨基酸序列有關[15-16]，因此本實驗采用免疫熒光標記的方法檢測星形膠質細胞的表達情況。

細胞凋亡是指為維持內環境穩定，細胞在多種因素作用下發生的自主性、程序性的細胞死亡方式，受到凋亡調控蛋白調控。Bax為Bcl-2家族的促凋亡基因，Bax為胞漿蛋白，自身可形成同源二聚體，當細胞受到刺激時破壞線粒體外膜，使其通透性增大，幫助細胞色素C穿過線粒體膜，激活Caspase-9，進而激活Caspase-3，加速細胞凋亡。Bcl-2為Bcl-2家族的抑凋亡基因，Bcl-2通過抑制促凋亡蛋白的釋放、抑制Caspase激活，穩定細胞內Ga2+、抗氧化、抑制Bax的細胞毒性等機制發揮作用。Bax/Bcl-2的比值決定了細胞的生存和死亡。Caspase-3是細胞凋亡最關鍵的效應蛋白酶，是多種凋亡刺激信號的最終匯集點，被稱為“細胞凋亡的執行者”[17-18]。本實驗結果表明，模型組大鼠海馬中Bax表達上升，Bcl-2表達下降，Bax/Bcl-2比值上升，說明CUMS能夠上調促凋亡蛋白Bax水平，下調抑凋亡蛋白Bcl-2水平，提高Bax/Bcl-2比值，能夠有效促進神經細胞凋亡，從而導致海馬體積萎縮，促使大鼠表現出抑郁狀態。

本研究顯示，對照組和模型組GFAP和Bax、GFAP和Caspase-3均可見共定位表達，模型組較對照組二者融合更廣泛。同樣，對照組和模型組GFAP和Bcl-2也可見共定位表達，但模型組二者融合明顯少于對照組。表明抑郁大鼠海馬星形膠質細胞的凋亡增加，可能參與了抑郁癥大鼠海馬體積的萎縮。然而細胞凋亡存在3種信號轉導途徑，受多種基因調控，本實驗僅探討了凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達變化情況，更多的凋亡機制及抑郁癥患者海馬體積異常的原因有待更深入的研究。