內(nèi)源性γ-干擾素對斑馬魚血管發(fā)育的影響

蔣偉青，袁 欣，劉 晨，任 瀟，王永剛

一個成熟的血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成需要經(jīng)過復(fù)雜的過程，包括血管發(fā)生、血管生成和其后伴隨的血管形成、血管穩(wěn)定、血管分支、血管修剪和血管分化[1]。已經(jīng)有許多研究報(bào)道了免疫系統(tǒng)在血管生成中的重要作用。而關(guān)于γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)對血管生成的作用，國內(nèi)外報(bào)道有著不同的結(jié)果。該研究擬以斑馬魚為模式生物，在體研究內(nèi)源性IFN-γ對血管發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物該實(shí)驗(yàn)所用的斑馬魚品系為Tg(Flk1:eGFP)，用于標(biāo)記斑馬魚內(nèi)皮細(xì)胞。每個實(shí)驗(yàn)組使用6條斑馬魚幼魚。斑馬魚胚胎養(yǎng)殖于10% Hanks溶液，放置于14 h/10 h明暗交替的28 ℃恒溫培養(yǎng)箱。

1.2胚胎顯微注射顯微注射是指在顯微鏡下，利用玻璃微電極將外源物質(zhì)注射入胚胎細(xì)胞的技術(shù)。玻璃微電極由外徑為1.0 mm、內(nèi)徑為0.58 mm的玻璃毛細(xì)管經(jīng)微電極拉制儀拉制而成。在注射前，將房間溫度調(diào)至20 ℃，以延緩受精卵分裂。在電極內(nèi)灌入要注射的反義嗎啉環(huán)寡聚核苷酸(morpholino oligomer，MO)后,將電極安裝在電極夾持器上并45°傾斜固定于顯微操作器上，鏡下將電極尖端修剪至適合口徑，使每次注射約1 nl。將待注射的物質(zhì)注射入一細(xì)胞期受精卵的動物極中。MO購自美國Gene Tools公司。該實(shí)驗(yàn)所用MO序列如下，對照MO：5’-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3’；crfb17 MO：5’-CGATGAGACACAGATCAATATCCGCAT-3’。利用電極將MO(2 ng)注入1-細(xì)胞期胚胎動物極，另注入等濃度的對照MO作為對照。

1.3斑馬魚活體共聚焦成像用于共聚焦成像的斑馬魚于胚胎受精后天數(shù)(day post fertilization，dpf)為1 dpf時去卵膜，并在Hanks溶液中加入0.003%的 N-苯基硫脲(1-phenyl-2-thiourea)防止其色素形成。成像前，將斑馬魚包埋于濃度為0.013 mg/ml的低熔點(diǎn)膠中。斑馬魚活體共聚焦成像使用Olympus Fluoview 1000激光共聚焦顯微鏡。成像中使用XLumplfl 20×(W/IR NA:0.95) 物鏡。光路、光電倍增管接收光譜范圍、pinhole大小及分光鏡等參數(shù)，采用Fluoview 1000軟件染料列表中給出的最優(yōu)參數(shù)。Z軸成像間距取3 μm。

1.4斑馬魚中腦血管三維結(jié)構(gòu)定量分析利用共聚焦顯微鏡對Tg(Flk1:eGFP)的斑馬魚胚胎進(jìn)行XYZ軸成像后，利用該實(shí)驗(yàn)室編寫的腦部血管三維結(jié)構(gòu)定量分析軟件對其中腦網(wǎng)絡(luò)血管特征進(jìn)行分析，包括中腦血管密度、中腦血管節(jié)段數(shù)和中腦血管密度。具體步驟如下：① 原始圖像處理：利用Image J軟件對原始圖片進(jìn)行區(qū)域選擇，范圍區(qū)域需包含所有中腦血管，范圍大小需與模板腦圖像的大小一致，選定區(qū)域后將圖像剪裁，隨后將原始圖像處理為從Z軸由深至淺排列的8位tiff圖；② 圖片等方向性插值：利用實(shí)驗(yàn)室自主編寫的軟件，在菜單欄property setting輸入原始圖片的XYZ軸分辨率，通過 equal insert將處理過得8位tiff圖進(jìn)行等方向性插值處理，并保存；③ 提取中腦血管：通過3D V/B match功能，將血管圖與模板腦圖片進(jìn)行Z軸方向重合，根據(jù)模板腦大小去除中腦以外的血管；④ 圖像分割和去燥：通過segment batch功能對灰度圖片進(jìn)行批量血管分割，分割閾值根據(jù)圖像的灰度值進(jìn)行人工設(shè)定，通過remove noise功能去除部分噪聲點(diǎn)；⑤ 圖像三維填充：通過fill 3D功能對分割后血管中的空隙進(jìn)行填充；⑥ 圖像三維重建和中腦血管精細(xì)提取：通過3D viewer binary images的points功能對填充處理過的圖像進(jìn)行三維重建顯示；在三維顯示界面下，將未去除干凈的中腦以外的血管去除，并以原始圖像為參照，將因信號過弱而導(dǎo)致斷裂的血管進(jìn)行小球填充，使其恢復(fù)連續(xù)性及原來的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)；⑦ 血管網(wǎng)絡(luò)骨架中心線：將所有血管端點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記并保存，通過centerline generation功能對血管網(wǎng)絡(luò)骨架中心線進(jìn)行提取,并根據(jù)原始圖像對存在錯誤的骨架中心線進(jìn)行刪除；⑧ 網(wǎng)絡(luò)特征提取：分別通過feature analysis下的brain和vessel功能提取腦體積和血管體積參數(shù)，通過Feature Analysis下Centerline中l(wèi)ength的功能提取血管長度和血管節(jié)段數(shù)參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1IFN-γ活動對斑馬魚腦血管發(fā)育的影響利用反義核苷酸技術(shù)，于斑馬魚胚胎1-細(xì)胞期分別將crfb17 MO和對照MO顯微注射入胚胎動物極，下調(diào)斑馬魚IFN-γ受體crfb17的表達(dá)，從而抑制內(nèi)源性IFN-γ的作用。由于斑馬魚腦血管發(fā)育時間窗為1.5～7 dpf，并在3 dpf時達(dá)到發(fā)育高峰[2]，將3 dpf設(shè)為觀察起始點(diǎn)。又由于crfb17 MO組的胚胎在6～7 dpf時狀態(tài)普遍不佳，出現(xiàn)心包嚴(yán)重水腫、脊柱彎曲等癥狀，將5 dpf設(shè)為觀察結(jié)束點(diǎn)。分別在3 dpf和5 dpf這兩個時間點(diǎn)對幼魚腦血管進(jìn)行活體三維熒光共聚焦成像(圖1)，結(jié)果顯示crfb17 MO組相較對照MO組，腦血管發(fā)育受到了明顯的抑制。

2.2中腦血管三維結(jié)構(gòu)定量分析利用軟件，對3 dpf時不同組別幼魚的中腦血管三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量分析，crfb17 MO組中腦血管總長度(5.7±0.8) mm、血管節(jié)段數(shù)(36.5±6.3)、血管密度(1.65%±0.22%)都較對照MO組[(9.2±1.3) mm、(62.5±5.1)、(2.75%±0.18%)]顯著降低(t=5.606、7.804、9.409，P<0.001，進(jìn)一步證實(shí)了下調(diào)內(nèi)源性IFN-γ活動后，斑馬魚腦血管生成受到了抑制。見圖2。

圖1 crfb17 MO對斑馬魚腦血管發(fā)育的影響 ×26

2.3crfb17MO對斑馬魚軀干血管發(fā)育的影響由于中樞血管與外周血管發(fā)育的調(diào)控因素存在較大差異，為了探索IFN-γ對外周血管發(fā)育的影響，我們對斑馬魚胚胎進(jìn)行相同的操作，并對軀干血管發(fā)育進(jìn)行觀察。斑馬魚軀干血管發(fā)育時間窗大致為胚胎受精后24～30 h(hours post fertilization，hpf)[2]，選取介于24～30 hpf的時間點(diǎn)，即28 hpf(此時斑馬魚幼魚的自發(fā)抖動較24 hpf時明顯減少，利于成像)作為觀察軀干血管發(fā)育的起始點(diǎn)，并于軀干血管發(fā)育結(jié)束后，即在31 hpf，再次進(jìn)行成像，作為觀察軀干血管發(fā)育的結(jié)束點(diǎn)。在正常斑馬魚軀干血管發(fā)育過程中，節(jié)間血管向背側(cè)生長，并通過背側(cè)縱向吻合血管(dorsal longitudinal anastomotic vessel，DLAV)相連接。圖3顯示，在28 hpf時，對照MO組已有少量DLAV連接相鄰血管，至31 hpf時，所有DLAV已經(jīng)長成并連接成管。而在crfb17 MO組中，從28 hpf至31 hpf，DLAV都沒有發(fā)育完全，說明下調(diào)crfb17后，斑馬魚軀干血管的發(fā)育受到了明顯抑制。

3 討論

本研究顯示，下調(diào)斑馬魚IFN-γ受體crfb17后，斑馬魚腦血管和軀干血管的發(fā)育受到明顯抑制；對腦血管進(jìn)一步的定量分析表明，3 dpf時crfb17 MO組中腦血管總長度、血管節(jié)段數(shù)、血管密度都較對照MO組顯著降低。

已經(jīng)有許多研究報(bào)道了免疫系統(tǒng)在血管生成中的重要作用。促炎性細(xì)胞因子如白介素6、白介素8和白介素1β等已被報(bào)道具有促進(jìn)血管生成的作用[3]。然而，IFN-γ一直被認(rèn)為是抑制血管生成的細(xì)胞因子[4-5]。IFN-γ對血管內(nèi)皮作用的研究主要基于腫瘤背景，IFN-γ不僅通過作用于腫瘤基質(zhì)細(xì)胞[6-7]，而且直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞[8-9]，達(dá)到抑制血管生長從而抑制腫瘤生長的效果。然而，也有相當(dāng)一部分研究顯示，IFN-γ具有促血管生成的作用。Trompezinski et al[10]和Liu et al[11]分別發(fā)現(xiàn)IFN-γ能促進(jìn)人角質(zhì)細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞釋放血管內(nèi)皮生長因子從而促進(jìn)血管生成。IFN-γ由免疫細(xì)胞產(chǎn)生，可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的活化，而Jetten et al[12]通過在小鼠腹腔血管生長基膜實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細(xì)胞能夠增加內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量和管狀結(jié)構(gòu)的形成。該研究顯示，抑制內(nèi)源性IFN-γ活動，斑馬魚的血管發(fā)育受到了明顯抑制，提示IFN-γ對斑馬魚血管發(fā)育的促進(jìn)作用。

圖2 3 dpf斑馬魚中腦血管三維結(jié)構(gòu)定量分析A：斑馬魚中腦血管三維骨架圖；B-D：斑馬魚中腦血管總長度、血管節(jié)段數(shù)、血管密度比較；與對照MO組相比：***P<0.001

圖3 crfb17 MO對斑馬魚軀干血管發(fā)育的影響 ×20紅色箭頭：指示對照MO組中已發(fā)育成形的DLAV

斑馬魚的基因組中含有十個編碼Ⅱ型細(xì)胞因子多肽的基因，其中兩個與哺乳動物IFN-γ最相關(guān)的基因?yàn)镮FN-γ1和IFN-γ2。其中IFN-γ1自斑馬魚胚胎0.5 hpf后就有持續(xù)的表達(dá)[13]。而ifng1-1和ifng1-2基因所表達(dá)蛋白的相應(yīng)受體皆為crfb17。IFN-γ在斑馬魚的早期發(fā)育中也起重要作用，IFN-γ已被報(bào)道參與斑馬魚胚胎早期膽道發(fā)育[14]和造血干細(xì)胞的形成[7]。

本研究顯示，通過抑制斑馬魚胚胎期內(nèi)源性IFN-γ的作用，斑馬魚的腦血管和軀干血管發(fā)育都受到了嚴(yán)重影響。此外，下調(diào)crfb17后，3 dpf斑馬魚腦血管發(fā)育受到抑制，而5 dpf時腦血管發(fā)育受抑制的現(xiàn)象更為明顯。由于3 dpf是斑馬魚腦血管發(fā)育的關(guān)鍵時期，胚胎腦血管發(fā)育在此時已受到抑制，另外，IFN-γ已被報(bào)道與斑馬魚胚胎早期胚胎發(fā)育中的重要作用[7,14]，加上crfb17 MO的持續(xù)作用，導(dǎo)致5 dpf時腦血管發(fā)育受抑制的現(xiàn)象比3 dpf時更明顯，進(jìn)一步反映了內(nèi)源性IFN-γ在長時程的腦血管發(fā)育過程中持續(xù)的重要作用。雖然大部分體外實(shí)驗(yàn)表明，外源性給予IFN-γ能抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，也有報(bào)道證明，低劑量IFN-γ能誘導(dǎo)細(xì)胞增殖而高劑量則反之[15]。結(jié)合前述研究背景，提出假說，生理性IFN-γ對血管發(fā)育具有促進(jìn)作用，而在病理狀態(tài)下，炎性IFN-γ可通過抑制血管的生長而達(dá)到控制病灶發(fā)展的作用。

IFN-γ作為促炎細(xì)胞因子，具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等特性。在腫瘤研究中IFN-γ起抑制血管生長的作用，而也有其他研究報(bào)道IFN-γ促血管生成的作用。本研究顯示，下調(diào)斑馬魚IFN-γ受體crfb17后，斑馬魚腦血管和軀干血管的發(fā)育受到明顯抑制，提示內(nèi)源性IFN-γ對斑馬魚血管發(fā)育中的促進(jìn)作用。該研究首次通過在體實(shí)驗(yàn)表明內(nèi)源性IFN-γ在血管發(fā)育階段對血管生成的促進(jìn)作用，期待后續(xù)進(jìn)一步的在體實(shí)驗(yàn)來證明內(nèi)源性IFN-γ對血管生長的調(diào)節(jié)作用。