長鏈非編碼CCAT1靶向miR-219a對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞生長、侵襲和遷移的調(diào)節(jié)作用

王圣坦，朱根海，洪 瀾，吳秀容，紀(jì) 武

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤之一[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年宮頸癌新發(fā)病例可達(dá)500 000人，每年宮頸癌死亡人數(shù)約為233 000人，嚴(yán)重威脅女性的生殖健康[2]。近年來巴氏涂片篩查法的廣泛應(yīng)用在一定程度上降低了宮頸癌死亡率，但宮頸癌患者的預(yù)后仍不容樂觀[3]。基因的改變是癌癥發(fā)生的根本原因，因此，從基因水平上深入探究宮頸癌的發(fā)病機(jī)制將有利于宮頸癌早期診斷和后期的治療。長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA,LncRNA)是近年來癌癥相關(guān)研究的一大熱點(diǎn)。研究[4-5]表明，結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1 (colorectal cancer associated transcript 1,CCAT1) 在多種癌細(xì)胞中均呈高表達(dá)狀態(tài)，能夠促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移，抑制癌細(xì)胞凋亡。沉默CCAT1表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，但其對(duì)宮頸癌細(xì)胞作用的機(jī)制還未見報(bào)道[6]。研究[7]表明，CCAT1調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的機(jī)制與調(diào)控其下游微小型RNA (microRNA,miRNA)的表達(dá)有關(guān)。該研究將采用shRNA沉默CCAT1表達(dá)以探究CCAT1對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖及遷移的作用及其與miR-219a的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液 (貨號(hào)：11875-093)、胎牛血清 (貨號(hào)：26400044) 和胰蛋白酶 (貨號(hào)：25200114) 購自美國Gibco公司；CCAT1 shRNA (sh-CCAT1) 慢病毒載體構(gòu)建由漢恒生物科技公司完成；miR-219a mimic和miR-219a inhibitor購自美國Invitrogen公司；BCA試劑盒 (貨號(hào)：C0037) 和CCK-8試劑盒 (貨號(hào)：P0010) 購自上海碧云天生物技術(shù)公司；TRIzol試劑盒、Prime Script反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex Taq II試劑盒購自日本TaKaRa公司；Ki67 (貨號(hào)：sc-23900)、半胱天冬酶(Caspase-3，貨號(hào)：sc-56053)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9，貨號(hào)：sc-21733)一抗和HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗 (貨號(hào)：sc-2005) 購自美國Santa Cruz公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國ThermoFisher公司；倒置顯微鏡購自日本Nikon公司；PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀購自美國ABI公司；電泳槽、半干轉(zhuǎn)膜儀和凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞(Hela細(xì)胞)購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。用含10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。3 d傳代1次。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染將細(xì)胞傳代培養(yǎng)于6孔板中，培養(yǎng)24 h后分別或同時(shí)加入sh-CCAT1慢病毒載體、miR-219a inhibitor、miR-219a mimic和不含目的基因的載體 (miR-219a mock)，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.4RT-PCR檢測(cè)用TRIzol試劑于冰上提取各組細(xì)胞總RNA，用Nanodrop 2000檢測(cè)RNA純度并選出純度較高的RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。用SYBR Premix Ex Taq II試劑盒進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)所用到引物均通過Primer 3進(jìn)行設(shè)計(jì)。CCAT1上游引物：5′-TTT ATGCTTGAGCCTTGA-3′，下游引物：5′-CTTGCCT GAAATACTTGC-3′；miR-219a上游引物：5′-CTC GCTTCGGCAGCACA-3′；下游引物：5′-GTCGTATC CAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATA CGACAGAATT-3′；GAPDH 上游引物：5′-TCCAA AATCAAGTGGGGCGA-3′；下游引物：5′-TGATGACC CTTTTGGC TCCC-3′。

1.5熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)通過生物信息預(yù)測(cè)has-miR-219a上有LncRNA CCAT1連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)，用RT-PCR擴(kuò)增具有兩者結(jié)合位點(diǎn)的片段并將該片段插入pMIR-REPORT 熒光素酶載體中，構(gòu)建has-miR-219a野生質(zhì)粒，再利用點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，構(gòu)建has-miR-219a突變質(zhì)粒。同時(shí)，將CCAT1插入到pMIR-REPORT 熒光素酶載體中，用不同量has-miR-219a野生質(zhì)粒(50 nm,100 nm)、has-miR-219a突變質(zhì)粒 (Mutant組) 或熒光素酶載體 (mimic-NC) 和CCAT1分別或同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，根據(jù)Dual Luciferase報(bào)告基因試劑盒說明書于避光環(huán)境下測(cè)定熒光素酶活性。

1.6CCK-8檢測(cè)將細(xì)胞分為sh-Ctrl組、sh-CCAT1組、miR-219a inhibitor組和sh-CCAT1 + inhibitor組，sh-Ctrl組用不含目標(biāo)片段的慢病毒處理，sh-CCAT1組加入sh-CCAT1進(jìn)行轉(zhuǎn)染，miR-219a inhibitor組加入miR-219a inhibitor進(jìn)行處理，sh-CCAT1 + inhibitor組則用sh-CCAT1和miR-219a inhibitor同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分別于轉(zhuǎn)染后的第1、2、3、4、5天用CCK-8試劑盒對(duì)細(xì)胞增殖速度進(jìn)行檢測(cè)。

1.7流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后用0.25%胰酶收集細(xì)胞，1 000 r/min離心4 min后，用緩沖液重懸沉淀，并將細(xì)胞密度調(diào)至5×105個(gè)/ml，隨后分別加入Annexin V和PI試劑避光孵育15 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Hela細(xì)胞凋亡程度。

1.8Transwell實(shí)驗(yàn)用sh-CCAT1和miR-219a inhibitor處理細(xì)胞后，收集細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104個(gè)/ml。將細(xì)胞接種于用基質(zhì)膠預(yù)包被的Transwell小室上層，用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，小室下層則加入含5%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用蘇木精對(duì)小室下層細(xì)胞染色，每孔隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

1.9Westernblot檢測(cè)用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液于冰上提取各組細(xì)胞蛋白，用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，用10% SDS-PAGE分離蛋白并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用脫脂牛奶封閉后，加入一抗 (Ki67,1 ∶1 400; Caspase-3,1 ∶1 000; MMP-9,1 ∶1 000) 于4 ℃孵育膜過夜，第2天棄去一抗并清洗后加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗于室溫封閉1 h，滴加化學(xué)發(fā)光顯色液用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1sh-CCAT1對(duì)宮頸癌細(xì)胞CCAT1表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CCAT1在宮頸癌細(xì)胞Hela中呈高表達(dá)狀態(tài)，sh-CCAT1能顯著降低Hela細(xì)胞CCAT1的表達(dá)水平，與sh-Ctrl組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=4.12，P<0.001)，表明sh-CCAT1轉(zhuǎn)染成功。見圖1。

圖1 CCT1對(duì)宮頸癌細(xì)胞CCAT1表達(dá)的影響與sh-Ctrl組比較：***P<0.001

2.2sh-CCAT1對(duì)宮頸癌細(xì)胞miR-219a表達(dá)的影響sh-CCAT1能顯著升高Hela細(xì)胞miR-219a的表達(dá)水平 (F=25.45，P<0.05)，miR-219a inhibitor可明顯抑制miR-219a表達(dá) (F=1.24，P<0.05)，sh-CCAT1能明顯減弱miR-219a inhibitor對(duì)miR-219a的抑制作用 (F=25.63，P<0.05)；此外，CCAT1能顯著抑制宮頸癌細(xì)胞miR-219a表達(dá) (F=1.02，P<0.05)，還能明顯減弱miR-219a mimic誘導(dǎo)miR-219a表達(dá)的作用 (F=1.96，P<0.05)。見圖2。

圖2 sh-CCAT1對(duì)宮頸癌細(xì)胞miR-219a表達(dá)的影響與miR-219a mock組比較：*P<0.05；與miR-219a組比較：#P<0.05

2.3CCAT1與miR-219a的靶向關(guān)系熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-219a野生質(zhì)粒能顯著減弱帶有CCAT1片段熒光素酶活性，并具有量效關(guān)系 (F=1.13，P<0.05)。結(jié)合位點(diǎn)突變后，miR-219a對(duì)CCAT1熒光素酶活性的調(diào)控作用消失，表明CCAT1與miR-219a存在靶向關(guān)系。見圖3。

2.4sh-CCAT1對(duì)宮頸癌細(xì)胞生存能力的影響與sh-Ctrl組比較，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后第4、5 天，sh-CCAT1組Hela細(xì)胞增殖速度明顯降低(F=2.78，P<0.05)，miR-219a inhibitor組細(xì)胞增殖速度明顯升高 (F=1.05，P<0.05)；與sh-CCAT1組比較，sh-CCAT1+inhibitor組細(xì)胞增殖速度明顯升高 (F=1.18，P<0.05)，見圖4。同時(shí)，sh-CCAT1組細(xì)胞Ki67蛋白表達(dá)水平明顯低于sh-Ctrl組 (F=2.25，P<0.05)，miR-219a inhibitor組Ki67表達(dá)水平明顯高于sh-Ctrl組 (F=0.28，P<0.05)；sh-CCAT1 + inhibitor組Ki67表達(dá)水平也顯著升高，與sh-CCAT1組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=4.13，P<0.05)。見圖5。此外，沉默CCAT1能顯著誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡 (9.7 ± 0.06) 及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá) (F=4.02，P<0.05)，miR-219a inhibitor能顯著抑制Hela細(xì)胞凋亡 (0.8 ± 0.2) 及Caspase-3的表達(dá) (F=9.00，P<0.05)，并且還可明顯減弱sh-CCAT1對(duì)細(xì)胞凋亡 (3.4 ± 0.4) 和Caspase-3表達(dá)的誘導(dǎo)作用 (F=4.01，P<0.05)，見圖5、6。

圖3 CCAT1與miR-219a的靶向關(guān)系1: mimic-NC組；2:miR-219a (50 nm)組；3: miR-219a (100 nm) 組；4:Muant組；與mimic-NC組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖4 sh-CCAT1對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響與sh-Ctrl組比較：*P<0.05；與sh-CCAT1組比較：#P<0.05

圖5 sh-CCAT1對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡和遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響1:sh-Ctrl組；2: sh-CCAT1組；3: miR-219a inhibitor 組；4: sh-CCAT1 + inhibitor；與sh-Ctrl組比較：*P<0.05,**P<0.01；與sh-CCAT1組比較：#P<0.05

圖6 sh-CCAT1對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響A:sh-Ctrl組；B: sh-CCAT1組；C: miR-219a inhibitor 組；D: sh-CCAT1 + inhibitor組

2.5sh-CCAT1對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲遷移能力的影響與sh-Ctrl組比較，sh-CCAT1組侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯減少 (F=4.00，P<0.05)，miR-219a inhibitor組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增多 (F=2.25，P<0.05)；與sh-CCAT1組比較，sh-CCAT1 + inhibitor組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增多 (F=4.23，P<0.05)，見圖7。同時(shí)，sh-CCAT1組細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白MMP-9表達(dá)水平與sh-Ctrl組比較明顯降低 (F=4.08，P<0.05)，miR-219a inhibitor組MMP-9表達(dá)水平明顯升高 (F=2.25，P<0.05)； sh-CCAT1 + inhibitor組MMP-9的蛋白表達(dá)水平也顯著高于sh-CCAT1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=2.25，P<0.05)，見圖5。

圖7 sh-CCAT1對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲遷移能力的影響 ×100A: sh-Ctrl組；B: sh-CCAT1組；C: miR-219a inhibitor 組；D: sh-CCAT1 + inhibitor組；與sh-Ctrl組比較：***P<0.001；與sh-CCAT1組比較：##P<0.01

3 討論

LncRNAs是一類不具蛋白質(zhì)編碼功能的RNA。近年來研究[8]表明，LncRNAs參與了機(jī)體基因表達(dá)的調(diào)控，其異常表達(dá)與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其是癌癥。宮頸癌是女性常見的生殖系統(tǒng)癌癥[9]。研究[10-12]表明，LncRNA GAS5、MEG3和XLOC 010588等在宮頸癌中表達(dá)降低。HOTAIR、EBIC、CCHE1和CCAT1等在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)明顯升高，其高表達(dá)能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，抑制癌細(xì)胞凋亡[6,13]。其中，CCAT1是一類位于轉(zhuǎn)錄因子C-Myc附近的LncRNA，其主要參與細(xì)胞周期和癌癥發(fā)生發(fā)展的調(diào)控[14]。正常細(xì)胞中，只有肝臟細(xì)胞和小腸細(xì)胞中可以檢測(cè)到微量的CCAT1[15]。本研究首先采用RT-PCR檢測(cè)了CCAT1在宮頸癌細(xì)胞Hela中的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CCAT1在宮頸癌Hela細(xì)胞中基因表達(dá)水平明顯升高，進(jìn)一步證明CCAT1可能是一類致癌基因。

研究[16]表明，LncRNAs與miRNA之間存在相互調(diào)控作用。LncRNAs與miRNAs之間的相互調(diào)控可影響細(xì)胞的生長、凋亡及癌癥發(fā)生和轉(zhuǎn)移[17]。LncRNAs可通過抑制miRNAs的表達(dá)抑制基因沉默復(fù)合物的形成，從而減弱miRNAs的基因沉默功能[17]。研究[7]表明，CCAT1可通過下調(diào)miR-181b的表達(dá)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲，沉默CCAT1可促進(jìn)miR-181b的表達(dá)。本研究首先通過生物信息預(yù)測(cè)顯示CCAT1與miR-219a可能存在靶向調(diào)控關(guān)系。進(jìn)一步研究表明，CCAT1過表達(dá)能顯著抑制Hela細(xì)胞miR-219a的表達(dá)，miR-219a mimic 能明顯減弱CCAT1對(duì)miR-219a的抑制作用。敲除CCAT1能明顯升高宮頸癌Hela細(xì)胞miR-219a的mRNA水平，提示CCAT1可能靶向調(diào)控宮頸癌Hela細(xì)胞miR-219a的表達(dá)。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步表明CCAT1和miR-219a之間存在靶向調(diào)控關(guān)系。

miRNAs可以調(diào)控多個(gè)生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖、存活、凋亡和轉(zhuǎn)移。miR-219a是一類抑癌基因，在多種癌細(xì)胞中均呈低表達(dá)狀態(tài)，上調(diào)miR-219a表達(dá)能抑制成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、肝癌、乳腺癌等癌細(xì)胞增殖[18-20]。本研究顯示沉默CCAT1能顯著抑制Hela細(xì)胞增殖，并能抑制增殖標(biāo)記蛋白Ki67的表達(dá)，同時(shí)sh-CCAT1還能誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)，miR-219a inhibitor能明顯減弱sh-CCAT1對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用，提示沉默CCAT1表達(dá)后，CCAT1對(duì)miR-219a的抑制作用消失，miR-219a表達(dá)顯著抑制了宮頸癌細(xì)胞增殖。表明CCAT1高表達(dá)可通過下調(diào)miR-219a表達(dá)促進(jìn)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖、抑制凋亡。

癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移是多類癌癥的生物學(xué)特性，并且與癌癥的發(fā)展密切相關(guān)。已有研究[21]表明，CCAT1能促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲和遷移。miR-219a能抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[19]。本研究表明，沉默CCAT1能顯著減弱宮頸癌Hela細(xì)胞侵襲遷移能力，抑制miR-219a表達(dá)能明顯促進(jìn)癌細(xì)胞遷移，并且還能明顯減弱sh-CCAT1對(duì)Hela細(xì)胞侵襲遷移能力的抑制作用，表明CCAT1能促進(jìn)宮頸癌Hela細(xì)胞侵襲和遷移，并且其作用機(jī)制與其下調(diào)miR-219a的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，沉默CCAT1能抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和遷移，同時(shí)還能誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與下調(diào)miR-219a的表達(dá)有關(guān)。本文首次探究了CCAT1對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞侵襲遷移能力的影響，發(fā)現(xiàn)CCAT1對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞作用的機(jī)制與抑制miR-219a的表達(dá)有關(guān)，可能為宮頸癌的治療提供了新的潛在治療靶標(biāo)。