8q24基因多態性和安徽人群前列腺癌的相關研究

梁前俊，張 力,2，樊 松,2，梁朝朝,2

前列腺癌 (prostate cancer,PCa)是一種常見的男性泌尿系統惡性腫瘤。PCa的病因有很多，從目前的流行病學研究來看，可遺傳的基因變異從中起著關鍵性作用。近年來全基因組關聯研究已經發現了許多與PCa風險相關的單核苷酸多態性位點[1]，這對進一步了解PCa提供了新的方向。8q24染色體上的遺傳變異已經證明與前列腺、結腸直腸、乳腺、膀胱等部位腫瘤的發病相關[2]。全基因組關聯研究[3]顯示人類染色體8q24上的幾種常見變體與增加PCa的風險密切相關，其中研究較多的3個獨立的PCa的風險區域(區域1:128.54～128.62,區域2:128.14～128.28,區域3:128.47～128.54)，rs10090154、rs16901966分別位于8q24區的風險區域1及風險區域2中。該文從基因水平研究8q24上2個SNP位點與安徽漢族人群PCa發病的相關性，并探討其與年齡、體重指數(body mass index，BMI)、收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、腫瘤分期、Gleason評分、血清前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)水平等臨床特征的關系。

1 材料與方法

1.1病例資料選取2014年9月～2016年6月安徽醫科大學第一附屬醫院90例PCa患者和139例健康對照者。病例組人群均為PSA≥4 ng/ml、經組織病理學確診的PCa患者；對照組均為PSA<4 ng/ml、無腫瘤病史和家庭腫瘤病史同期進行常規體檢的健康人群。本研究通過安徽醫科大學醫學倫理審查委員會的審查，按照知情同意原則收集PCa患者與健康對照的血樣。同時從患者醫療記錄中收取相關臨床資料，其中包括診斷年齡、BMI、SBP、腫瘤分期、Gleason評分、PSA水平。

1.2基因分型分析取受試者抗凝外周靜脈血2 ml，用全基因組DNA提取試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)進行DNA提取。對于每例DNA樣品，通過MassARRAY法檢測rs10090154、rs16901966多態性。從GenBank查取rs10090154、rs16901966附近的基因序列，由Assay Designer軟件包進行引物設計并進行引物合成。PCR體系制備：分別取2.8 μl去離子純水，0.5 μl含0.02 mol/L MgCl2的10×PCR緩沖液，0.4 μl 0.025 mol/L MgCl2，0.1 μl 0.025 mol/L dNTP Mix，1 μl PCR 引物Mix，0.2 μl 5 U/μl DNA聚合酶至1.5 ml管配制PCR Mix，(該體系為單孔反應)分裝至384 孔板后，加入1 μl DNA，渦旋震蕩和離心。PCR的反應條件：95 ℃預變性2 min、95 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min共44個循環，后于72 ℃終延伸5 min。在PCR反應結束時，用堿性磷酸酶(SAP)處理PCR產物以從系統中除去游離的dNTP，堿性磷酸酶處理完成后進行單堿基延伸反應，后將延伸產物用清潔樹脂純化，將純化的PCR產物送至上海吉凱基因化學技術有限公司測序。

1.3統計學處理采用STATA 12.0軟件進行相關統計分析，運用Hardy-Weinberg平衡檢驗(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)對對照組樣本基因型分布頻率進行檢驗，計算比值比(odds ratio，OR)及其95%可信區間(confidence interval,CI)來評價相對風險，P<0.05為差異有統計學意義，檢驗均為雙側。病例組和對照組樣本中rs10090154、rs16901966 位點基因型和等位基因頻率運用χ2檢驗進行分析，分層分析及PCa患者相關臨床資料差異同樣使用χ2檢驗計算。8q24區rs10090154、rs16901966基因型、等位基因與PCa相關性及PCa患者rs10090154、rs16901966在腫瘤分期、Gleason評分、確診時PSA濃度的易感性分析結果使用多因素Logistic回歸分析經年齡、BMI、收縮壓因素進行校正。

2 結果

2.1研究人群的特征所納入90例PCa患者及139例健康患者的人口特征見表1。患者組年齡48～87(73.00±7.64)歲，對照組年齡60～95(67.66±6.69)歲，兩組人群的年齡差異有統計學意義(P<0.001)，兩組人群間的BMI指數和SBP差異無統計學意義。本篇rs10090154、rs16901966對照組樣本中基因多態性的基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P=0.276、0.559)，說明對照組人群代表性均較好。

表1 病例組和對照組的一般情況

2.28q24基因rs10090154、rs16901966多態性和PCa相關性分析關于rs10090154病例組和對照組多態性基因型分布見表2。總體而言，相對于野生CC基因型，PCa組中CT雜合模型(P=0.001,OR=3.147,95%CI: 1.616～6.127)及CT/TT顯性模型(P=0.001,OR=3.008,95%CI:1.572～5.574)基因頻率比在對照組中要高；PCa患者的T等位基因頻率比對照組高(P=0.006,OR=2.062,95%CI: 1.226～3.467)，提示rs10090154的風險等位基因T與PCa的患病風險呈正相關性。

表2 8q24區rs10090154基因型、等位基因與PCa的相關分析

a：使用多因素Logistic回歸分析經年齡、BMI、收縮壓等因素校正后的P值；b：使用多因素Logistic回歸分析經年齡、BMI、收縮壓等因素校正后的OR值

關于rs16901966病例組和對照組多態性基因型分布見表3。相對于野生AA基因型，PCa組中AG雜合模型(P=0.042,OR=1.899,95%CI:1.023～3.524)、GG純合模型(P=0.008,OR=4.090,95%CI:1.446～11.570)及AG/GG顯性模型(P=0.009,OR=2.190,95%CI: 1.217～3.941)基因頻率比在對照組中要高；G等位基因的頻率在PCa患者要比對照組高(P=0.007,OR=1.737,95%CI:1.160～2.600)，提示rs16901966風險等位基因G與PCa的患病風險也呈正相關性。

表3 8q24區rs16901966基因型及等位基因和PCa的相關分析

a：使用多因素Logistic回歸分析經年齡、BMI、收縮壓等因素校正后的P值；b：使用多因素Logistic回歸分析經年齡、BMI、收縮壓等因素校正后的OR值

2.38q24基因rs10090154、rs16901966多態性和PCa相關性分層分析rs10090154、rs16901966病例對照組多態性亞組型分布見表4。rs10090154位點在年齡≤70歲(P=0.002,OR=3.814,95%CI:1.634～8.901)、BMI>23 kg/m2(P=0.001,OR=3.449,95%CI:1.629～7.303)、SBP≥140 mmHg(P=0.008,OR=3.148,95%CI:1.352～7.328)的人群中相對于野生基因型CC，突變基因型CT/TT可能有較高的PCa發病風險；rs16901966位點在年齡>70歲(P=0.024,OR=2.567,95%CI:1.132～5.818)、BMI>23 kg/m2(P=0.029,OR=2.030,95%CI:1.074～3.838)的人群中，突變基因型AG/GG PCa的發病率比野生型AA更高。

2.4PCa患者臨床特征與基因型的關聯分析將PCa患者按照不同臨床分期、Gleason等級和PSA值分別分為2個亞組(局限型和進展型、低級別≤7和 高級別>7、PSA≤20 ng/ml和PSA> 20 ng/ml)，比較病例組中8q24基因rs10090154、rs16901966位點變異型和野生型基因頻率的差異，并沒有觀察到顯著的相關性，見表5。

表4 8q24 rs10090154、rs16901966基因型頻率和PCa相關性的分層分析

表5 PCa患者rs10090154、rs16901966在腫瘤分期、Gleason評分、確診時PSA濃度的易感性分析

a:使用多因素Logistic回歸分析經年齡、BMI、收縮壓等因素校正后的P值; b:使用多因素Logistic回歸分析經年齡、BMI、收縮壓等因素校正后的OR值

3 討論

盡管許多研究[4]都表明遺傳基因變異多態性和癌癥的發生有關，但是對于基因多態性具體怎樣影響癌癥的發生還不清楚。8q24染色體片段長約600 000 bp,目前發現該區域內有多個SNP位點與癌癥的發病風險存在相關性[5]，其中rs10090154、rs16901966就是其中兩個位點。

到目前為止，rs10090154基因多態性和許多癌癥的關系已經被報道，Cortessis et al[6]在美國人群和中國人群做了一個病例對照研究，探討rs10090154和膀胱癌的關系，結果提示rs10090154多態性位點可能和膀胱癌的發生無關。Curtin et al[7]在歐洲人群中發現rs10090154和結直腸癌的發生有關，可提高結直腸癌的發病率。rs10090154多態性和PCa的關系也有很多人報道過，其中的結果不盡一致， Benford et al[8]在非洲人群中發現rs10090154多態性和PCa發病無關，張政 等[9]在中國北方人群發現rs10090154和PCa發生無關。而有許多文獻[10-12]顯示中國人群rs10090154多態性和PCa發病有關，并且能夠提高PCa的發病風險。Ren et al[13]在中國人群中做了一項關于rs10090154多態性和PCa發病關聯的薈萃分析，結果顯示在rs10090154多態性可提高PCa的發病率。在本篇文章病例對照研究的結果提示rs10090154多態性和PCa的存在相關性，與上述薈萃分析的結果一致，Benford et al[8]和張政 等[9]結果的差異可能同種族差異及樣本量較小相關。

相對于8q24區rs10090154，關于rs16901966多態性和癌癥的關系研究較少，但是在僅有的文章里都是研究該位點和PCa的風險相關性[10-11,14-15]，Zhao et al[11]在中國北方人群中發現PCa 患者rs16901966-G風險等位基因明顯高于健康人群; Liu et al[14]發現在中國北方人群中攜帶rs16901966 非AA型基因PCa的易感性更高，AA 型基因可能為PCa的保護性基因。本研究得出的結論與之一致，即rs16901966-G 等位基因在PCa人群中的分布高于健康人群，G等位基因可能為PCa發病的危險性基因。

本研究同時探討了8q24 rs10090154、rs16901966位點風險基因和相關臨床特征的相關性， rs10090154 PCa發病與變異基因型CT/TT患者的年齡、BMI、SBP有關，提示患者在年齡≤70歲、BMI>23 kg/m2時誘發PCa的風險較大；rs16901966位點在年齡>70歲、BMI>23 kg/m2的人群中，突變基因型AG/GG PCa的發病率比野生型AA更高，以上結果說明PCa的患病和年齡及BMI有關，并且當BMI>23 kg/m2，所研究的兩個位點變異基因攜帶罹患PCa的風險均更高。同時對rs10090154、rs16901966位點變異基因型與PCa患者不同PCa分期、Gleason 評分、PSA相關性進行了分析，并未發現具有統計學意義的結果，此結果和王剛 等[16]分析的結果一致，不同于Liu et al[15]分析的結果，其差異可能與遺傳背景、環境因素如飲食、生活方式、環境污染等有關系。