老年散發性結直腸癌中hMLH1、hMSH2、hMSH6的表達及與預后的相關性

張良良， 宋 蒨，石紅建，任景麗，卞曉星

近年來結直腸癌的發病率與死亡率上升至第3位和第4位[1]。結直腸癌總數的95%[2]左右為散發性結直腸癌(sporadic colorectal carcinoma,SCC)。SCC中15%是由錯配修復(mismatch repair,MMR)蛋白表達缺失而引起的[3]。MMR基因的功能在于維持基因復制的準確性，翻譯正常的錯配修復蛋白，發揮抗腫瘤作用，如其發生突變或甲基化，致癌基因將得到聚集，導致腫瘤發生[4]。隨著人口老齡化，老年SCC患者不斷增多，且SCC患者中現仍以老年人為主[5]，但MMR在老年SCC中的研究則較少，老年SCC患者中MMR的具體作用需要進一步的分析研究。基于此，該研究將探討老年SCC患者中MMR蛋白hMLH1、hMSH2和hMSH6的表達及與預后的相關性，旨在為老年SCC患者的診療及對預后的估計提供參考依據。

1 材料與方法

1.1病例資料篩選從2009年6月～2012年6月江蘇大學附屬武進醫院病理科SCC術后的標本，共232例，分為老年組152例(年齡≥65歲)，非老年組80例(年齡<65歲)。老年組患者年齡65～86(73.71±7.63)歲，非老年組患者年齡30～59(46.8±8.56)歲。入組標準：① 所有患者具有完整的臨床信息；② 術前均未進行放、化療；③ 均經術前及術后病理檢查，明確診斷為SCC；④ 分期均為Ⅱ-Ⅲ期，分期符合美國癌癥聯合委員會(AJCC)第七版分期標準[6]。其中Ⅱ期結腸癌患者包括以下至少一項高危因素：組織學分化差﹙Ⅲ或Ⅳ級)、標本檢出淋巴結不足(少于12枚)、T4、脈管浸潤、術前腸梗阻或腸穿孔；⑤ 化療方案均應用FOLFOX方案。

1.2方法在MMR系統中，MMR基因主要依賴hMLH1、hMSH2和hMSH6蛋白發揮作用[7]，因此采用免疫組織化學方法測定上述蛋白的表達情況。步驟：將標本用40 g/L的甲醛固定，石蠟包埋，按5 μm的厚度連續切片，用PV-9000二步法，常規HE染色，于組織細胞狀態較好處，用免疫組織化學法染色，一抗為hMLH1、hMSH2、hMSH6鼠抗人單克隆抗體(北京中杉金橋生物有限公司)，陰性對照以磷酸鹽緩沖液代替一抗做陰性對照。以正常結直腸黏膜上皮或浸潤的淋巴細胞為陽性對照。

1.3結果判定結果判斷標準：① 按將陽性細胞所占的比例進行評分：無陽性細胞為0分，陽性細胞≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>76%為4分；② 將染色程度進行評分：棕褐色為3分，棕黃色為2分，淡黃色為1分，無色為0分；染色程度評分和陽性細胞的比例評分的乘積≥2分，判定為MMR蛋白表達正常，<2分判定為表達缺失。以正常的結直腸黏膜上皮核染色作陽性對照。hMLH1、hMSH2、hMSH6均表達正常判定為表達正常(proficient mismatch repair，pMMR)，否則判定為表達缺失(deficient mismatch repair，dMMR)。

1.4隨訪每3～6個月對患者進行一次隨訪；隨訪內容包括：治療方案、是否復發、復發時間、生存時間等。隨訪截至日期為2017年6月，隨訪時間為11～60個月。

1.5統計學處理應用SPSS 21.0軟件對資料進行分析。計數資料比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法對生存時間曲線進行繪制，并以Log-rank檢驗進行比較。單因素及多因素分析采用Cox比例風險模型，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1MMR蛋白的表達情況老年組共有26例MMR蛋白表達缺失，缺失率為17.71%(26/152)；非老年組共有21例MMR蛋白表達缺失，缺失率為26.25%(21/80)，兩組相比，差異無統計學意義(P=0.100)。見圖1。

圖1 MMR蛋白免疫組織化學圖 ×100A：hMLH1蛋白；B：hMSH2蛋白；C：hMSH6蛋白；1：表達正常；2：表達缺失

2.2MMR蛋白表達與SCC患者臨床病理特征的關系老年組：dMMR組患者和pMMR組患者在分期、分化程度、腫瘤大小、淋巴結轉移方面差異有統計學意義(P<0.05)；與pMMR組相比，dMMR組患者更多見于高分化、Ⅱ期、腫瘤直徑≥5 cm的患者，更難發生淋巴結轉移。非老年組：dMMR組患者和pMMR組患者在分期、分化程度、淋巴結轉移方面差異有統計學意義(P<0.05)；與pMMR組相比，dMMR組患者更多見于高分化、Ⅱ期的患者，更難發生淋巴結轉移。見表1。

2.3MMR表達與SCC患者預后的關系老年組：dMMR組的5年生存率為84.62%(22/26)，高于pMMR組56.35%(71/126)，差異有統計學意義(χ2=9.001，P=0.003)。非老年組：dMMR組的5年生存率為80.95%(17/21)，高于pMMR組49.15%(29/59)，差異有統計學意義(χ2=6.991，P=0.008)。見圖2。

2.4單因素和多因素分析單因素分析結果顯示：

表1 MMR表達缺失組和MMR表達正常組患者臨床病理特征比較(n)

圖2 SCC患者dMMR組與pMMR組生存時間比較A:老年組；B:非老年組

表2 影響患者生存時間的單因素 COX 回歸分析結果

RR：相對危險度

表3 老年組生存時間的多因素 COX 回歸分析結果

RR：相對危險度

表4 非老年組生存時間的多因素 COX 回歸分析結果

RR：相對危險度

MMR狀態、腫瘤分化程度、組織學類型與老年組和非老年組患者預后顯著相關(P<0.05)。多因素分析結果顯示：MMR狀態、分化程度為影響老年組患者生存時間的獨立因素(P<0.05)；MMR狀態、組織學類型為影響非老年組患者生存時間的獨立因素(P<0.05)。見表2～4。

3 討論

結直腸癌的發病率及死亡率呈逐漸上升的趨勢，其中MMR基因的突變或甲基化導致結直腸癌的發生，這一途徑越來越受到重視。MMR基因的正常表達，可識別并糾正錯配的堿基，保持基因轉錄翻譯的穩定性，避免腫瘤的發生[8]。隨著人口老齡化和醫療水平的提高，老年SCC患者的數量越來越多，研究MMR在老年SCC患者中的作用顯得非常重要。老年組MMR蛋白表達缺失率為17.71%，低于非老年組的26.25%，或許是因為非老年組樣本量較少的原因，差異無統計學意義，但可反映這有可能是SCC患者年輕化趨勢的原因之一。相關研究[9]表明，MMR蛋白的表達狀態與SCC患者的臨床病理特征有明顯的相關性。本研究顯示，在老年SCC患者中，dMMR組患者更多見于Ⅱ期、高分化、腫瘤直徑≥5 cm的患者，更難發生淋巴結轉移。dMMR組的患者發生淋巴結轉移的比例要比pMMR組低，這與Park et al[10]的研究結果一致，這或許是dMMR組患者預后較好的原因之一。

與pMMR組患者相比，dMMR組患者更多為Ⅱ期、高分化的腫瘤，早期及高分化的腫瘤，預后往往較好，這些均可能是dMMR組患者預后更好的原因。dMMR組患者更多為體積較大的腫瘤(直徑≥5 cm)，這些患者由于腫瘤體積較大，發生腹痛、排便習慣改變等臨床癥狀和腸穿孔、腸梗阻、出血等并發癥的時間較早，更早地發現、及時治療意味著更好的預后。對于非老年組患者，MMR表達狀態與患者的分期、分化程度、淋巴結轉移方面顯著相關，與腫瘤直徑無明顯相關性，這與老年組患者不同。研究[11]表明，MMR蛋白與SCC患者的生存時間有明顯的相關性。Zaanan et al[12]認為，dMMR患者的生存時間顯著長于pMMR患者，FOLFOX輔助化療有益于dMMR患者。也有一些學者認為，含5-Fu的化療方案對dMMR患者無明顯的作用[13]。本研究顯示，MMR蛋白表達缺失是老年SCC患者預后好的指標，Cox回歸分析結果表明：MMR狀態為影響SCC患者生存時間的獨立因素。兩組患者均于術后應用FOLFOX方案進行化療，結果dMMR組的5年生存率高于pMMR組，差異有統計學意義。因此，對于伴有高危因素的老年Ⅱ-Ⅲ期SCC中MMR表達缺失的患者，建議應進行術后輔助化療。對于MMR影響SCC患者預后的具體機制，仍未完全闡明，有多種觀點。Scarpa et al[14]認為，相比MMR蛋白表達正常的SCC患者，MMR蛋白表達缺失的SCC患者中，免疫監視功能明顯增強，可顯著影響患者的預后。Zhang et al[15]則認為dMMR結直腸癌的免疫微環境與pMMR的不同。

本研究未將MMR蛋白表達狀態分別與Ⅱ期、Ⅲ期SCC患者的臨床病理特征及預后的關系進行研究，有待大規模、更為細致的研究驗證上述結論。

綜上所述，老年SCC患者MMR蛋白的表達狀態與其臨床病理特征及預后有明顯的相關性，dMMR組患者更多見于Ⅱ期、高分化、腫瘤直徑≥5cm的患者，更難發生淋巴結轉移。MMR狀態為影響老年SCC患者預后的獨立因素，dMMR組患者較pMMR組患者預后更好。