肺微浸潤性腺癌EGFR基因突變特征及臨床意義

李 明，柯 立，李傳應，詹瑪琍，程 民

近年來肺癌的發病率及死亡率不斷攀升，已成為腫瘤相關死亡的主要原因[1]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌主要類型，靶向治療使NSCLC的治療效果有了卓越提升。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是與NSCLC靶向治療密切相關的驅動基因，其在優勢人群中的突變率為10%～50%[2]。攜帶EGFR敏感突變的晚期NSCLC患者可從EGFR小分子酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)靶向治療中獲益。

快速準確地評價EGFR基因突變狀態對于制定NSCLC個體化治療方案具有重要意義。腫瘤臨床病理學特征可預測EGFR基因狀態，因此可作為初步評估指標。近年來隨著早期篩查流程的完善，中國人群中早期肺癌已成為就診肺癌中的重要類型。目前早期肺腺癌，如原位腺癌(adenocarcinoma in situ,AIS)及微浸潤性腺癌(microinvasion adenocarcinoma,MIA)中EGFR基因突變特征及臨床意義的研究較少。該研究將分析肺MIA中EGFR基因突變狀態與臨床病理參數的相關性，并進行亞組分析，比較19Del及L858R突變型患者的臨床病理特征差異，以期揭示兩種突變型肺MIA臨床病理背景的差異，從而為肺MIA分子分型的必要性提供依據，并為MIA臨床處理及預后評估提供指導。

1 材料與方法

1.1病例資料選取2015年1月～2017年6月期間于安徽省立醫院(中國科學技術大學附屬第一醫院)CT檢查發現肺部結節，后手術切除治療的病例共79例，均滿足以下入組條件：依據2015版WHO肺腫瘤分類診斷標準，病理診斷證實為肺MIA[3]；可獲取腫瘤組織用于EGFR基因突變檢測；所有病例手術前未接受過放、化療及其他治療。所有手術切除腫瘤組織經10%中性緩沖福爾馬林固定及常規石蠟包埋。收集臨床病理學資料。所有病例的病理診斷、腫瘤微浸潤性成分組織學亞型以及微浸潤病灶最大徑均由3位病理醫師根據IASLC/ATS/ERS及WHO 診斷分類標準進行獨立評價，意見不一致的病例經討論以達成共識。入組病例年齡39～82歲，中位年齡58歲。所有病例計算吸煙指數(吸煙指數=每日吸煙量×吸煙年數)，吸煙指數≥400定義為吸煙病例；從未吸煙定義為不吸煙病例。

1.2EGFR基因突變檢測采用QIAamp DNA FFPE Tissue試劑盒(德國Qiagen公司)從腫瘤組織中提取基因組DNA；對于腫瘤細胞比例<50%的組織，利用宏切割方法富集腫瘤細胞后再提取核酸。紫外分光光度計(NanoDrop 2000，Thermo Fisher公司)檢測核酸濃度及評價純度。采用Amoy Diagnostics EGFR基因突變檢測試劑盒(廈門艾德生物醫藥有限公司)，通過擴增阻滯突變系統-多聚酶鏈式反應(amplification refractory mutation system-real time polymerase chain reaction,ARMS-PCR)方法檢測腫瘤組織EGFR基因狀態，檢測涵蓋EGFR基因4個外顯子的29種突變類型。依據試劑盒說明，設置PCR反應條件：第一階段，95 ℃預變性5 min，1個循環；第二階段，95 ℃變性25 s，64 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，15個循環；第三階段，93 ℃變性25 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸20 s，31個循環；在第三階段60 ℃時收集FAM及HEX信號。每次檢測均設置陽性及陰性對照，每例樣本均設置外部及內部質控對照以保證核酸模板質量和排除PCR抑制劑存在的可能。

1.3統計學處理采用SPSS 13.0軟件進行分析。全組及亞組計數資料均應用χ2或Fisher精確檢驗方法進行相關性分析。所有檢驗均為雙邊檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1肺MIAEGFR基因突變狀態79例肺MIA中，EGFR野生型者19例(24.05%)，EGFR基因突變者60例(突變率75.95%)；其中外顯子19缺失突變(19Del)28例(突變率35.44%)，外顯子21 L858R點突變(L858R)30例(突變率37.97%)；此外，EGFR稀有突變2例(突變率2.53%)，其中1例攜帶單點稀有突變(外顯子18 G719X點突變)，1例攜帶稀有雙突變(外顯子18 G719X點突變合并外顯子20 S768I點突變)。

2.2肺MIAEGFR基因突變與臨床病理學參數的相關性肺MIA EGFR基因狀態與腫瘤微浸潤性成分組織學亞型、腫瘤內纖維化及免疫細胞浸潤情況顯著相關(P<0.01)；與患者年齡、性別、吸煙狀況、腫瘤部位、大小、數目、微浸潤病灶最大徑、外周血淋巴細胞百分比及影像學是否表現為磨玻璃樣結節無顯著相關性，見表1。EGFR基因突變常好發于微浸潤性成分組織學亞型為附壁型及腺泡型者(P<0.01)，同時也好發于腫瘤內出現顯著纖維化及免疫細胞浸潤者(P<0.01)。

2.3肺MIAEGFR基因突變亞型與臨床病理學參數的相關性亞組分析分別比較了兩種常見的EGFR突變亞型(19Del及L858R)與臨床病理參數的相關性。結果顯示，肺MIA EGFR基因19Del或L858R突變均與腫瘤大小、微浸潤灶最大徑、腫瘤內存在纖維化及免疫細胞浸潤顯著相關(P<0.01，P<0.05)；與患者年齡、性別、吸煙狀況、腫瘤部位、數目及微浸潤成分組織學亞型等無顯著相關性，見表2。

2.419Del及L858R突變型肺MIA臨床病理特征的比較進一步比較了19Del及L858R突變型肺MIA之間臨床病理特征的差異。19Del突變多好發于腫瘤病灶≤1 cm(P<0.01)、腫瘤微浸潤灶最大徑≤0.2 cm(P<0.01)、腫瘤內缺乏顯著纖維化及免疫細胞浸潤的肺MIA病例(P<0.01)；與L858R突變組相比，差異有統計學意義，見圖1。L858R突變則多好發于腫瘤病灶>1 cm(P<0.01)、腫瘤微浸潤灶最大徑>0.2 cm(P<0.01)、腫瘤內存在顯著纖維化及免疫細胞浸潤的肺MIA病例(P<0.01)；與19Del突變組相比，差異有統計學意義(圖1)。其他臨床病理學背景特征，包括年齡、性別、吸煙狀態、影像學表現、腫瘤部位、數目、微浸潤性成分組織學亞型及外周血淋巴細胞百分比，結果顯示兩種EGFR突變亞型的肺MIA之間無顯著差異。

3 討論

近年來由于篩查流程逐漸完善，肺MIA已成為臨床實踐中肺癌的重要類型，但其EGFR基因突變特征及臨床意義尚不明確，僅有少數基于日本人群的研究提示EGFR突變多見于MIA[4-5]。本研究分析了79例肺MIA的EGFR基因突變特征，結果顯示肺MIA中EGFR基因突變率為75.95%。EGFR基因突變譜顯示19Del及L858R為主要突變亞型，這與在浸潤性腺癌中觀察到結果一致[6]；此外本研究檢測到2例稀有突變，其中1例攜帶稀有雙突變?；诒狙芯拷Y果，推測肺MIA中EGFR基因突變具有獨特的分子病理學特點，如突變率更高及更易出現稀有突變等，需要更大樣本量的研究進一步證實。

表1 肺MIA EGFR基因突變與臨床病理參數的相關性

aGGO(ground glass opacity)：磨玻璃樣結節影;b入組病例微浸潤灶最大徑的平均值為0.2，如果存在多灶性浸潤，則按照多灶性浸潤性病灶的百分比之和乘以腫瘤最大徑計算數值;c其他指附壁型及腺泡型之外的微浸潤灶組織學亞型，包括乳頭狀、微乳頭狀及實性亞型;d入組病例外周血淋巴細胞百分比平均值為30%

表2 肺微浸潤性腺癌EGFR基因突變亞型與臨床病理參數的相關性

aGGO (ground glass opacity)：磨玻璃樣結節影；b入組病例微浸潤灶最大徑的平均值為0.2；如果存在多灶性浸潤，則按照多灶性浸潤性病灶的百分比之和乘以腫瘤最大徑計算數值；c其他指附壁型及腺泡型之外的微浸潤灶組織學亞型，包括乳頭狀,微乳頭狀及實性亞型；d入組病例外周血淋巴細胞百分比平均值為30%。

EGFR基因突變可作為EGFR-TKIs治療晚期NSCLC的療效預測因子，最近多項研究開始探討TKIs在早期肺癌治療中的療效及安全性[7-10]。明確肺MIA中EGFR基因突變特征及臨床意義有助于探討肺癌發生的早期分子機制及制定合理的早期肺癌臨床處理策略。本研究首先分析了EGFR突變狀態與MIA臨床病理學特征的相關性，結果顯示EGFR突變多發生于微浸潤性成分為附壁狀或腺泡狀組織亞型的MIA(表1)，這與在浸潤性腺癌中觀察到的結果相似[5]。此外，本研究顯示EGFR突變多見于腫瘤內存在顯著纖維化及免疫細胞浸潤的MIA病例(表1)，目前尚無肺癌中EGFR突變與此兩種病理特征的相關性研究。基于本研究結果，推測腫瘤內纖維化及免疫細胞浸潤可提示肺MIA乃至浸潤性腺癌存在EGFR突變。另一方面，有研究[11-12]提示腫瘤微環境改變，包括腫瘤內纖維化及免疫細胞浸潤，可影響腫瘤細胞增殖及浸潤；并提出此兩種組織學特征可作為某些腫瘤的預后標志物。綜合以上結果，推測肺MIA中EGFR突變狀態與腫瘤預后有相關性，有待于進一步的研究論證。

圖1 19Del及L858R突變型肺MIA臨床病理特征的比較亞組1：腫瘤大小≤1 cm(n=46)； 亞組2： 1 cm<腫瘤大小≤2 cm(n=33)；亞組3：腫瘤微浸潤灶最大徑≤0.2 cm(n=34)； 亞組4：0.2 cm<腫瘤微浸潤灶最大徑≤0.5 cm(n=45)；亞組5：腫瘤內存在纖維化(n=46)；亞組6：腫瘤內缺乏纖維化(n=33)； 亞組7：腫瘤內存在免疫細胞浸潤(n=38)；亞組8：腫瘤內缺乏免疫細胞浸潤(n=41)；與L858R突變率比較：**P<0.01

本研究進一步分析了EGFR 19Del及L858R突變亞型與臨床病理學特征之間的相關性。亞組分析顯示EGFR 19Del及L858R突變均與腫瘤大小及微浸潤灶最大徑有顯著相關性，亞組分析與全組分析結果之間的差異性表明不同EGFR突變亞型的肺MIA具有顯著不同的臨床病理學特征。另一方面本研究比較了19Del及L858R突變型MIA之間的臨床病理特征，結果顯示兩者存在差異，尤其是兩者具有不同的腫瘤微環境病理特征，體現在腫瘤內纖維化及免疫細胞浸潤。鑒于此兩種組織學特征可能作為腫瘤的預后標志物[11-12]，因此推測肺MIA臨床結局與EGFR突變亞型密切相關，但需要進一步研究證實這一假說。有研究[2,13]提示19Del及L858R突變型肺浸潤性腺癌之間存在著臨床特征、生物學行為及對TKIs療效的差異，但尚無研究探討兩種EGFR突變型MIA之間的差異。本研究結果提示不同EGFR突變亞型的MIA在病理組織學特征、預后等方面可能不同，臨床處理中需要區別對待。MIA真實預后情況尚未完全明確[14]，少數報道顯示早期肺癌中EGFR突變狀態與預后無相關性[15]。本研究結果初步提示EGFR突變亞型可作為肺MIA臨床研究中預后分層的分子標志物，但有待于進一步的研究證實。

本研究提示肺MIA可能具有特殊的EGFR基因突變譜。全組分析顯示不同EGFR基因狀態的肺MIA具有不同的臨床病理特征，EGFR突變狀態與腫瘤預后有相關性；亞組分析顯示19Del及L858R突變型肺MIA之間存在顯著差別，應被視為不同腫瘤。本研究初步探討了肺MIA EGFR基因突變特征及臨床意義，并為證實在肺MIA預后評估及臨床處理過程中進行分子分型的必要性提供了初步依據。