T-SPOT.TB試驗在活動性結核病診斷中的應用價值

景淑賢 陳寶榮 趙培明 常曉鵬 賈曉鵬 徐云智 韓玉霞 李莉

結核病（TB）是由結核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病。研究資料[1]顯示全球有大約1/3的人曾感染過結核分枝桿菌，且近年發病率持續增高。因此，TB的預防和控制顯得尤為重要。我國是結核病高發區，如何早期發現潛在的結核病患者是結核病防治的重點工作之一。目前臨床實驗室常用的診斷結核的方法有結核菌培養、抗酸染色、結核菌素皮試試驗(TST)、熒光定量PCR、抗結核抗體檢測(TB-Ab)和T細胞酶聯免疫斑點試驗（T-SPOT.TB）等，但各指標對結核病診斷的靈敏度和特異度不同。為評價T細胞酶聯免疫斑點試驗（T-SPOT.TB）在結核病快速輔助診斷中的應用價值，對2016年1～6月我院結核門診就診的200例疑似活動性結核病患者的T-SPOT.TB、TB-Ab、抗酸染色三項檢查的結果進行回顧分析，并與臨床最終診斷進行比較，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象2016年1～6月我院結核門診就診的200例疑似活動性結核病患者。年齡15～85歲，平均(50.0±20.0)歲；男125例，女75例。入選標準：年齡15～85歲的疑似活動性結核病患者，排除孕婦和哺乳期婦女；3項檢查均送檢。排除標準：診斷不明確病例和失訪病例。

1.2 研究方法

1.2.1 患者樣本采集、送檢與測量 ①T-SPOT.TB試驗：抽取入選患者空腹外周靜脈血5ml，肝素抗凝；抗結核抗體試驗：黃帽采血管分離的血清；抗酸染色：留取入選患者清晨起床漱口后咳出的深部的痰。②送檢要求：2h內送檢。③測量：就診時記錄體檢情況并同時進行T 細胞酶聯免疫斑點試驗（T-SPOT.TB）(上海復星長征醫學科學有限公司的T-SPOT.TB試劑盒)、抗結核抗體（TB-Ab）試驗[法國VEDA LAB公司的TB-CHECK-1結核桿菌抗體檢測試劑盒（免疫層析法）]、抗酸染色三種檢查。

1.2.2 確診病例入選 根據《肺結核診斷標準（WS 288-2008）》和《北京市結核病防治工作規范（2013年版）》，綜合考慮臨床癥狀、病原學、組織病理學、影像學等實驗室檢查或診斷性抗結核治療有效等做出最終臨床診斷。

1.2.3 對入選患者的臨床確診結果與來我院就診時的上述三項指標檢驗結果進行回顧分析，比較上述3個項目對活動性結核診斷的靈敏度和特異度。

1.3 統計學方法采用SPSS 19.0軟件進行數據處理。同時將入選患者的臨床結果及每種檢測方法的檢測結果建立四格表。靈敏度指真正患病被準確的診斷為患病的百分比，反映一項試驗檢出患者的能力。特異度指真正無病被準確的診斷為未患病的百分比，反映一項試驗檢出非患者的能力。用卡方檢驗將各組靈敏度和特異度分別進行比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

200例疑似結核病患者最終臨床診斷為結核病者110例，非結核病90例。3種方法檢測結果與臨床診斷結果見表1。T-SPOT.TB、TB-Ab、抗酸染色的靈敏度分別為94.55%、40.00%、10.91%，兩兩比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。T-SPOT.TB、TB-Ab、抗酸染色的特異度分別為77.78%、84.44%、100.00%。T-SPOT.TB與TB-Ab的特異度比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；T-SPOT.TB 與抗酸染色的特異度比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；TB-Ab與抗酸染色的特異度比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。

表1 3種方法檢測結果與臨床診斷結果比較（n）

3 討論

本研究中T-SPOT.TB診斷活動性結核病的靈敏度為94.55%，明顯高于其他兩種檢測方法的靈敏度，多篇文獻[2～7]報道的T-SPOT.TB診斷活動性結核病靈敏度為84.5%～97.9%，本研究與文獻報道基本一致。本研究中T-SPOT.TB的特異度為77.78%，與TB-Ab特異度比較無明顯差異，二者都低于抗酸染色的特異度。下面基于T-SPOT.TB原理對活動性結核病患者T-SPOT.TB呈假陰性和非活動性結核病患者T-SPOT.TB呈假陽性原因進行分析討論。

T-SPOT.TB試驗由Lalvani等[8]在2001年創建，于2008年美國FDA批準用于結核感染的診斷。其檢測原理是機體被結核分枝桿菌感染后體內淋巴細胞被致敏，當這些已致敏T淋巴細胞再次受到結核分枝桿菌特異性抗原ESAT-6和CFP-10刺激后，就會釋放干擾素-γ（IFN-γ），再通過事先進行設計的抗體捕獲細胞所分泌的特殊細胞因子通過酶聯斑點顯色表現出來。實驗室技術人員通過計數酶聯免疫斑點就可以于單細胞水平針對細胞因子的分泌狀況進行檢測。

本研究中5.45%(6/110)的活動性結核病患者T-SPOT.TB呈假陰性，目前的研究表明，出現假陰性的原因可能與淋巴細胞的數量與功能有關，也存在部分獨立風險因素。本研究中考慮到T-SPOT.TB檢測中每個孔的淋巴細胞計數會調整到統一的水平（2.5×105/孔），可以排除淋巴細胞數量減少對T-SPOT.TB靈敏度的影響。淋巴細胞的功能：研究表明[9～12]，結核分枝桿菌逃避了機體的免疫反應，造成免疫功能異常。逃避方式一：結核分枝桿菌進入巨噬細胞后通過釋放大分子物質阻止內含體與溶酶體融合，進而阻止激活特異性免疫反應；逃避方式二：結核分枝桿菌可以干擾MHCⅡ類分子的合成與轉運，進而影響T淋巴細胞識別活化；逃避方式三：結核分枝桿菌本身的毒力也可導致細胞死亡。獨立風險因素：年齡增加、超重以及住院前有較長病程（＞6個月），Pan 等[13]的研究表明這部分患者淋巴細胞對結核特異抗原的免疫應答弱化或異常應答，導致T-SPOT.TB檢測假陰性。

本研究中22.22%(20/90)的非活動性結核病患者T-SPOT.TB呈假陽性，有12例患者肺部CT提示為陳舊性結核，可能與記憶性 T 淋巴細胞長期存在有關。Kim 等[14]研究發現，既往結核病病史和影像學資料提示的鈣化纖維增殖灶干擾T-SPOT.TB試驗結果。另外8例患者既往無結核病接觸史且肺部CT也未顯示明顯的鈣化纖維增殖灶，T-SPOT.TB呈假陽性，可能與潛伏期結核分枝桿菌感染有關。考慮到我國是結核病高發國家，較大部分患者處于結核分枝桿菌潛伏感染狀態長期處于休眠期而呈現結核感染潛伏狀態。惡性腫瘤、強直性脊柱炎、應用免疫抑制劑患者本身可導致機體免疫力的下降，進而增加了結核分枝桿菌感染的風險。Zhu等[15]報道高危人群（非結核肺疾病患者）感染結核分枝桿菌的風險較一般人群大。文獻報道[6]當感染堪薩斯分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌、海分枝桿菌和戈登分枝桿菌時， T-SPOT.TB檢測可能出現假陽性結果。

綜上所述，T-SPOT.TB試驗對活動性結核病診斷的靈敏度高，同時其屬于體外實驗，24～48h能夠得到檢測結果，安全快速。可作為活動性結核病診斷的篩選指標，但對高度疑似活動性結核病而T-SPOT.TB試驗陰性結果時應注意患者是否存在免疫功能缺陷的情況。