文冠果降血壓肽的制備及其活性研究

張 齊,閻怡竹，劉清清,李 聰,申燁華,鄧建軍

(1.西北大學 食品科學與工程學院, 陜西 西安 710069;2.西北大學 化工學院,陜西 西安 710069；3.西北大學 化學與材料科學學院, 陜西 西安 710069)

文冠果(XanthocerasSorbifoliaB.)別名木瓜、文官果、文登閣等[1],系無患子科文冠果屬[2],是中國特有的珍稀木本油料植物,分布在山西、陜西、甘肅、吉林、內蒙古等14個省份,有著“北方油茶”的美譽[3]。文冠果種仁中油(質量分數)為59.86%,其中不飽和脂肪酸高達9.00%(體積分數)[4],具有降低膽固醇、軟化血管等藥用價值[5];蛋白質占比25.75%(質量分數),有18種氨基酸,必需氨基酸種類齊全,且氨基酸評分較高,具有較高的營養價值[6]。文冠果種仁主要應用于生物柴油的生產[2],然而,加工后的種粕除了部分用于飼料加工外,大多數被丟棄,不僅造成了資源的極大浪費,也會造成一定的環境污染[4]。文冠果蛋白本身具有良好的加工性能,可作為優良的蛋白質來源,添加在食品生產中。目前國內關于文冠果種仁蛋白的研究多在蛋白組分相關方面,對于其深加工產品的研究十分有限。

高血壓一種全球性的公共健康問題,可誘發很多慢性疾病,如中風、心梗、冠心病等[7]。血管緊張素轉化酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)是一種含鋅二肽羧肽酶,對人體血壓有重要的調控作用[8]。ACE抑制肽俗稱降血壓肽,是一類從食源性蛋白質中分離得到的具有降高血壓活性的多肽[9],一般只含有2～20個氨基酸殘基[10],可以快速地通過消化黏膜進入血液循環[11]。ACE抑制肽可與ACE兩個活動功能區競爭性結合,抑制ACE活性,抑制血管緊張素I轉化為血管緊張素II,從而起到降壓作用[9]。從食源蛋白質中得到的降血壓肽因其食用安全性高已成為國內外學者研究的熱點[12]。目前已經從紅松仁[11]、蘑菇[13]、榛果[14]、高粱[15]、羅非魚[16]、牛乳[17]、大豆[18]、牡蠣[19]等食品的蛋白酶解產物中分離出ACE抑制肽。

本文采用酶解法對脫脂文冠果蛋白進行酶解,以水解度為指標優化酶解工藝,同時,對文冠果多肽的體外抗高血壓活性進行研究,不僅豐富了文冠果副產品的深加工,也為文冠果功能性多肽的研究提供了數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

文冠果購于萬順種業有限公司。

木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、復合蛋白酶、中性蛋白酶，西安浩天有限公司;ACE、馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)，美國Sigma公司;牛血清蛋白(純度≥99%的分析純)，美國Ameresco公司;電泳蛋白質Marker，重慶科潤生物醫藥研發有限公司;電泳試劑，美國Usbiological公司;其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

超濾杯，美國Millipore公司;透析袋(3500 Da)，奧豪斯儀器(上海)有限公司;超濾膜(1kDa和5 kDa)，OHAOS儀器有限公司;旋轉蒸發器RE-52A、恒溫振蕩器SHA-B，上海亞榮生化儀器廠;冷凍干燥機LGJ-FD-1，宇輝儀器有限公司;紫外可見分光光度計UV-1780，日本島津;高速低溫冷凍離心機TGL-206R，上海安亭科學儀器廠;臺式電熱恒溫干燥箱WHL-25A，天津市泰斯特儀器有限公司;蛋白質電泳儀，美國Bio-Rad公司。

1.3 方 法

1.3.1 文冠果種仁的基本成分分析 水分的測定方法參照GB5009.3-2016《食品中水分的測定》，灰分的測定方法參照GB5009.4-2016《食品中灰分的測定》，粗脂肪的測定方法參照GB5009.6-2016《食品中脂肪的測定》，蛋白質的測定方法參照GB5009.5-2016《食品中蛋白質的測定》。

1.3.2 文冠果種仁蛋白的制備 文冠果去殼—粉碎—正己烷旋蒸去油—油渣風干后稱取80g溶于800mL磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate Buffer Saline, PBS 0.1MpH7.4)—懸濁液過濾后,得種仁蛋白溶液—分段鹽析(硫酸銨飽和度:0～20%，20～40%，40～60%，60～80%，質量分數)—取沉淀,用少量PBS溶解—透析(48 h)—冷凍干燥—蛋白粉。

1.3.3 文冠果多肽的制備 蛋白粉用蒸餾水溶解(底物質量濃度為40 g/L)—80℃恒溫震蕩10 min—冷卻到室溫—調節pH 9.0—加入適量酶—恒溫震蕩一段時間(保持pH 9.0)—90℃滅酶10 min,立即冷卻—4000 r/min冷凍離心15 min—取上清液抽濾—超濾(5 kDa和1 kDa)—冷凍干燥—多肽粉。

1.3.4 酶解工藝優化 加酶量4%(質量分數),酶解時間2 h,其他條件同1.3.3,選用中性蛋白酶、復合蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶,考察酶的種類對水解度的影響;堿性蛋白酶,酶解時間2 h,其他條件同1.3.3,加酶量分別為4%，6%，8%，10%，12%(質量分數),考察加酶量對水解度的影響;堿性蛋白酶、加酶量8%(質量分數),其他條件同1.3.3,酶解時間分別為25，50，75，100，125，150，175，200 min,考察酶解時間對水解度的影響。

1.3.5 水解度的測定 參照Adler-Nissen[20]的方法,采用pH-stat法計算水解度,在水解過程中,pH值穩定在9.0,記錄加入堿液的體積。水解度計算公式如下:

DH/%=(B×Nb)/(htot×Mp×α)×100

(1)

式中:B為耗堿體積,mL;Nb為堿液濃度,mol/L;α為氨基平均解離度;Mp為蛋白質量,g;htot為底物蛋白總肽鍵數,mmol/g。

1.3.6 體外ACE抑制率的測定 參照Cushman[21]的方法,并稍作修改。HHL在ACE的催化下快速分解產生馬尿酸和二肽His-Leu。當加入酶解液,ACE活性受到抑制,馬尿酸和二肽的生成量減少,而在228nm處,乙酸乙酯對馬尿酸有特征吸收,可以通過測定馬尿酸的生成量評價ACE抑制率。取酶解液,對其ACE抑制活性進行測定。依次于試管中加入5 mmol/L HHL溶液200 μL酶解液100 μL,在37℃恒溫水浴中預熱10 min,然后加入20 μL ACE(酶活為0.1 U/mL)啟動反應,在37℃恒溫水浴30 min,加入300 μL 鹽酸(1.0 mol/L HCl) 終止反應,加入1.5 mL乙酸乙酯,混合均勻后離心(4 000 r/min,10 min)取上層乙酸乙酯1.0 mL移于另一個試管,在120℃烘箱中烘干,取出試管后冷卻到室溫,加入3.0 mL蒸餾水,在228 nm處測定吸光值,ACE抑制率計算公式如下:

ACE/%=(A-B)/(A-C)×100

(2)

式中:A為樣品用硼酸;B為樣品酶解液;C為反應前加入HCl。

1.3.7 蛋白濃度的測定 參照Bradford[22]的方法,并稍作修改,采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。精確稱取牛血清蛋白10 mg,溶于10 mL蒸餾水中,稀釋為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL標準蛋白溶液,取100 μL蛋白溶液,加入5 mL考馬斯亮藍染液,立即旋渦混勻,5 min后,在595nm處測定吸光值,繪制標準曲線。

1.3.8 聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE) 采用5%的濃縮膠、20%的分離膠,對0～20%，20%～40%，40%～60%，60%～80%(質量分數)分段鹽析出的蛋白進行SDS-PAGE電泳分析,開始選擇恒壓80 V,待條帶跑到分離膠下端,調節電壓120 V直至電泳結束。染色40min后,脫色24 h,凝膠成像系統拍照。

1.4 統計分析

采用Origin 2015軟件處理數據。采用SPSS 20.0軟件(SPSS Inc, Chicago, IL, USA)進行單因素方差分析(p<0.05)所有試驗至少重復3次。

2 結果與分析

2.1 文冠果種仁的基本成分分析

對文冠果種仁中水分、灰分、蛋白質及粗脂肪含量分析如表1所示,其中粗脂肪和蛋白質質量分數最高,分別為60.9%和21.8%。結果表明:文冠果種仁富含脂肪和蛋白質,可作為油脂和植物蛋白開發的理想原料。這與張東[23]在文冠果油脂肪酸、甘油三酯組成及其相關性分析研究和阮瑜琳[24]在水酶法同時提取文冠果油及蛋白質的研究中的結果一致。

表1 文冠果種仁的化學成分Tab.1 The chemical constituents of Xanthocerassorbofolia Bunge seed

2.2 文冠果種仁蛋白的制備

為了得到文冠果蛋白水解肽,首先采用飽和硫酸銨鹽析法制備了蛋白原料,所用的飽和硫酸銨濃度為0～20%，20%～40%，40%～60%，60%～80%(質量分數)。對透析后的4個區段的文冠果種仁蛋白電泳行為進行分析,SDS-PAGE電泳圖譜如圖1所示。結果表明:不同區段的蛋白質種類和組成存在較為明顯的差異。在4個區段中60%(質量分數)鹽析蛋白質組成最為豐富,主要由9條譜帶構成(Mr分別約為63，55，43，40，36，34，26，22和6～13 kDa);80%(質量分數)鹽析蛋白質主要由5條譜帶構成(Mr分別約為55，40，26，17和1～10kDa);40%(質量分數)鹽析蛋白質主要由5條譜帶構成(Mr分別約為55，40，24，22和8～13kDa);20%(質量分數)鹽析蛋白質主要由4條譜帶構成,相比40%(質量分數)鹽析蛋白少了24kDa1條譜帶。比較4個區段,還可以看出:3條譜帶(Mr分別約為55，40和10 kDa)是4個區段共有的,但同一種蛋白質在不同區段中的含量是不同的(如55 kDa的蛋白質在80%(質量分數)區段中含量最高)。另外,60%(質量分數)鹽析蛋白的22 kDa和80%(質量分數)鹽析蛋白的10 kDa兩處條帶清晰,未來可以對這兩個區域進行進一步的鑒定,確定分離純化的片段。

泳道M:Marker; 泳道1-4:分別為飽和硫酸銨濃度為0～20%,20%～40%,40%～60%，60%～80%(質量分數)的蛋白譜帶圖1 文冠果蛋白質分子量分布電泳圖Fig.1 The protein molecular weight distribution electrophoresis of Xanthoceras sorbifolia bunge

2.3 酶解工藝優化

將上述各區段飽和硫酸銨濃度下收集的蛋白冷凍干燥后進行酶解,以水解度為考察指標,對其制備工藝參數進行單因素優化,探究酶的種類、加酶量、酶解時間對水解度的影響。pH值改變能影響酶活性中心上必需基團的解離程度,同時影響底物和輔酶的解離程度,從而影響酶分子對底物分子的結合和催化作用[25],選取酶解pH為9.0,此時文冠果蛋白的溶解度良好,而且四種酶都未失活。酶解溫度適當,可以加快酶促反應的進行,溫度過高,會導致酶活性減弱[26],選取酶解溫度55℃。

2.3.1 酶的種類對水解度的影響 在底物質量濃度40 g/L、加酶量4%(質量分數)、酶解pH9.0、溫度55℃和時間2h的條件下,比較了中性蛋白酶、復合蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶4種酶對文冠果蛋白的酶解效率。結果表明:堿性蛋白酶的水解效果最好,水解度達到18.21%;復合蛋白酶次之，水解度為13.79%。相比之下,中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解度顯著降低,分別為8.34%和6.96%。酶解pH 9.0時堿性蛋白酶的活性高于其他3種酶,水解更徹底。因此,選擇堿性蛋白酶作為酶解用酶。

圖2 酶的種類對水解度的影響Fig.2 Effect of different proteases on degree of hydrolysis

2.3.2 加酶量對水解度的影響 在底物質量濃度40 g/L、堿性蛋白酶、酶解pH9.0、溫度55℃和時間2h的條件下,比較了加酶量對文冠果蛋白的酶解效率。結果表明:隨著酶量的增加,水解度呈現先升高后降低的趨勢。加酶量在4%～6%(質量分數)時,大量蛋白質分子快速地被水解為小分子多肽,水解度由10.04%增加至17.12%;加酶量在6%～8%(質量分數)時,反應體系中酶濃度增大,底物與酶的結合達到飽和,水解度上升極為緩慢,加酶量為8%(質量分數)時,水解度達到最大值為18.26%;繼續加大酶量,導致酶濃度過大不利于蛋白的水解,水解度反而下降。因此,加酶量選擇8%(質量分數)。

圖3 加酶量對水解度的影響Fig.3 Effect of the enzyme dosage on degree of hydrolysis

2.3.3 酶解時間對水解時間的影響 在底物質量濃度40 g/L、加酶量8%(質量分數)(堿性蛋白酶)、酶解pH9.0和溫度55℃的條件下,比較了酶解時間對文冠果蛋白的酶解效率。結果表明:隨著酶解時間的延長,水解度呈現上升趨勢。在25～100 min內,水解度上升極為迅速。由于酶可作用的肽鍵逐漸減少,酶催化反應達到平衡狀態,175 min后水解度已趨于平穩。繼續延長時間,浪費資源且水解度不會大幅上升。因此,酶解時間選擇175 min。

圖4 酶解時間對水解度的影響Fig.4 Effect of the enzymatic time on degree of hydrolysis

2.4 文冠果體外ACE抑制肽的活性研究

在底物質量濃度40 g/L、酶解pH 9.0、溫度55℃、加酶量8%(質量分數)(堿性蛋白酶)和時間175 min的條件下,酶解文冠果種仁蛋白,得到的酶解液經超濾劃分成3個肽段:<1 kDa，1～5 kDa和>5kDa,測定3個組分肽段的ACE抑制率。結果表明:3個組分都具有一定的ACE抑制活性,其中< 1kDa組分的ACE抑制活性最高為83.43%,<1 kDa的多肽存在具有高ACE抑制活性的肽片段,因此,選擇<1 kDa的多肽進一步分離純化。

圖5 不同肽段的ACE抑制率Fig.5 ACE inhibitory rate of different peptides

選用< 1kDa的文冠果多肽,探究多肽濃度與ACE抑制率的依賴關系。結果表明:多肽濃度在0.2～1.0 mg/mL時,ACE抑制率隨著多肽濃度的增大而升高,二者呈劑量依賴關系。多肽濃度愈高,存在的具有ACE抑制活性的片段愈多,對ACE的抑制效果越強。經計算,文冠果多肽的IC50為0.394mg/mL。

圖6 不同濃度的多肽的ACE抑制率Fig.6 The ACE inhibition rate of different concentration of polypeptide

3 結 論

本文采用鹽析法提取文冠果蛋白,以水解度為指標,優化酶解工藝,最優條件為:底物質量濃度為40 g/L、酶解pH 9.0、酶解溫度55℃、加酶量8%(質量分數)(堿性蛋白酶)和酶解時間175 min,此條件下水解度最佳,可達22.97%。采用酶解法制備文冠果多肽,<5kDa的多肽回收率可達75%,其中<1kDa的多肽具有高的體外抗高血壓活性,ACE抑制率可達83.43%,IC50為0.394 mg/mL。可以進一步對ACE抑制肽進行分離純化,并配合多種光譜學技術對多肽的結構進行系統的表征研究。