黑木耳多糖提取方法比較研究

馬思琦　朱佳雪　周莉華

引言

多糖廣泛存在于高等植物、真菌、藻類中，主要由醛糖和酮糖通過糖苷鍵連接起來。黑木耳（Auricularia heimuer F.Wu，B.K.Cui &Y.C.Dai;）又名木耳、耳子、云耳等，屬藥食兼用真菌，是我國珍貴的食用和藥用的真菌，黑木耳富含多糖、纖維素等大量活性物質，營養豐富，其中多糖是黑木耳中最有效的活性成分之一，[1]黑木耳多糖具有降血糖、降血脂、抗血栓形成、提高機體免疫功能、抗衰老、改善心肌缺氧、抗潰瘍、抗放射以及對組織損傷具有保護作用，同時還能促進核酸、蛋白質的生物合成，并防治多種老年疾病，具有重要的研究價值。近年來，隨著糖科學和糖技術的發展，黑木耳多糖已經日益被人們所重視。確定黑木耳多糖的最佳提取工藝，便能提高黑木耳多糖的提取效率，降低黑木耳多糖的開發成本及損耗，由此獲得雜質更少純度更高的黑木耳多糖，為人類的健康和安全提供更為有利的幫助。[2]

本研究擬使用水提法，纖維素酶法、微波提取法、超聲波輔助提取法提取黑木耳多糖，通過正交實驗選擇最佳的黑木耳多糖提取工藝，為黑木耳的深加工提供參考。

一、實驗條件與方法

1.實驗材料

（1）原料：黑木耳產自黑龍江省大興安嶺。

主要試劑：濃硫酸、苯酚、石油醚、葡萄糖、乙醇、氫氧化鈉，來自國產分析純。纖維素酶（4萬U/g）購自山東龍元生物工程有限公司

（2）主要實驗儀器設備

AL04型電子天平（梅特勒-托利多有限公司），V-1100D紫外分光光度計（上海美譜達儀器有限公司公司），HH-2型水浴鍋（浙江力辰儀器科技有限公司），THYD-500機械式小型超聲波清洗儀（北京天佑恒達科技有限公司），G80F20CN2L-B8（R0）型微波爐（格蘭仕）。

2.實驗方案

在同等條件下，比較熱水浸提法、纖維素酶提取、微波提取法、超聲波輔助提取法對黑木多糖的影響。[3]

（1）熱水浸提法

粉碎干黑木耳，用石油醚脫脂，取5.0g黑木耳粉，加入去離子水，通過水浴浸提，離心得上清液，用無水乙醇沉淀，離心，干燥得到粗多糖。黑木耳粉與水之比為1：50，在90℃水浴中抽提2h。

（2）纖維素酶法

取5.0g黑木耳粉，按照1∶50（g/ml）加入pH 5.0，0.05 mol/L 檸檬酸鈉緩沖溶液，加入纖維素酶1 %（加酶量/木耳干重），50 ℃反應1h，用適量NaOH溶液調至中性，迅速升溫至85℃，反應1h，4000 r/min 離心20 min，取上清液，用無水乙醇沉淀，4℃ 靜置6 h，離心干燥得到粗多糖。

（3）微波輔助提取法

取5.0g黑木耳粉，加入去離子水，用微波處理，微波輻射功率為800w，輻射時間為40min，固液比（g：mL）為1：50，水浴浸提2h，離心得到上清液，用無水乙醇沉淀，離心，干燥得到粗多糖。

（4）超聲波輔助提取法

取5.0g黑木耳粉，加入去離子水，用超聲波處理，水浴浸提2h，離心得到上清液，用無水乙醇沉淀，離心，干燥得到粗多糖。超聲波功率40W、PH4.5、提取時間2h，提取溫度45℃。

（5）黑木耳粗多糖純化

取干燥粗黑木耳多糖稱量后加蒸餾水（W：V=1：50）溶解，再加等體積0.1mol/l的溴化十六烷基三甲銨（CTAB）與硼酸-硼砂緩沖液充分混勻，靜置，離心，沉淀用2mol/l乙酸溶解，離心，上清液加入等體積乙醇，靜置24h離心，沉淀用乙醇洗滌兩次，凍干即為純化黑木耳多糖。

（6）黑木耳多糖提取率的測定。

1.葡萄糖標準曲線的繪制

準確稱取 0.1043 g 葡萄糖，溶解后定容于 250mL 容量瓶中，分別取 5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25mL、30 mL 溶液，配制不同濃度的葡萄糖溶液，以確保葡萄糖濃度與吸光度的關系為線性關系。

2.用苯酚硫酸法測定多糖，精確吸取多糖樣品溶液2ml加入1ml苯酚溶液和5ml濃硫酸，其余同標準曲線之操作，測定吸光度值，由標準曲線計算樣品溶液中多糖含量。[4]

多糖提取率（%）=C×V×N×100/1000W式中，C，比照標準曲線的多糖濃度（mg/ml），V，提取液總體積（ml），N，稀釋倍數；W，黑木耳原料（g）。

二、實驗結果與分析（不低于2000字，表格采用三線表格式，圖片尺寸最大為：高650×寬120mm）

1.葡萄糖標準曲線的繪制

以葡萄糖濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標制，做標準曲線得到圖1

2.不同方法提取香菇多糖的結果

不同方法提取多糖結果比較，表1

在相同的浸泡時間、相同料水比，下纖維素酶法、微波提取法、超聲波輔助提取法所得的粗多糖的質量都高于熱水浸提法，超聲波輔助提取法所得的粗多糖質量最高0.588g，經純化處理后多糖損失較多，纖維素酶法經純化后純化多糖含量最高，多糖得率最高達3.46%。其次是超聲波輔助提取法，得率為2.96%，得率最低的是熱水浸提法。由此結果可以看出纖維素酶提取方法由于其他三種方法。纖維素酶法與傳統的熱水浸提法相比具有條件溫和，雜志易除和得率高等優點。

確定纖維素酶法提取黑木耳多糖的最佳提取工藝，還需要進行單因素實驗，如最佳溫度、最佳料液比，最佳浸泡時間，最佳酶量都要進行實驗才能得到最佳的提取方法。

結語

本實驗采用不同方法浸提黑木耳得到粗多糖，然后采用相同工藝純化粗多糖，結果表明用纖維素酶法從黑木耳中提取多糖，相對于其他方法提取的多糖純度好，得率高，纖維素酶法浸提所得粗多糖經純化處理多糖含量達93.24%，綜合分析黑木耳多糖提取以纖維素酶浸提效果最佳。但在提取過程中有很多因素影響多糖的得率，例如加酶量，隨著加酶量的增加，出現先增加后降的趨勢，要選擇最佳的加酶量，還要注意pH的影響，酶解時間的影響；由于真菌體內有水解酶共存，所以必須采用適當的方法破壞或者抑制酶的活性；黑木耳原料的粉碎情況對其多糖的提取有較大的影響。如果顆粒過大，多糖就不容易提出，如果粉碎過細，則比表面積反而減小，也不利于多糖的溶出；黑木耳多糖提取時，料水比要合適，過少，在沒有達到最佳蒸煮時間之前，浸出液已經變得很少，甚至糊鍋，從而影響多糖含量，若加水過多，則浸出液過多，不利于以后的分離濃縮。

參考文獻

[1]何偉峰.等.黑木耳多糖的酶法提取工藝優化[J].食用菌.2013.35（06）：67-69.

[2]鄧啟.黑木耳多糖分離純化及其對大豆分離蛋白糖基化的研究[D].東北林業大學.2015.

[3]于海洋.等.黑木耳多糖提取方法及生物活性的研究進展[J].中國林副特產.2017（01）：52-55.

[4]李凡姝.等.黑木耳多糖提取的工藝研究[J].農產品加工.2016（18）：13-16+20.

*通訊作者

陳瑞鵬（1983—），女，漢族，山東濰坊，副教授，碩士，方向為護理教育。