重慶地區兔腹瀉病原菌分離鑒定及檢測方法的建立

許國洋，沈克飛，徐登峰，付利芝，張素輝，王孝友，楊 柳

(重慶市畜牧科學院，重慶 402460)

近年來，隨著畜牧業的不斷發展，養兔業已成為重慶地區一項發展潛力巨大的產業。但由于重慶地區的獨特地理特征和濕熱氣候環境，為病原菌滋生創造了有利條件，成為疫病多發的主要誘因之一，嚴重影響養兔業的健康可持續發展。兔腹瀉是一類臨床上表現腹瀉癥狀的疾病，表現為排糞頻繁，糞便稀軟，呈粥樣或水樣便，輕者食欲減退，精神不振，排糞稀軟，呈粥樣或水樣，病兔全身反應較輕，虛弱、消瘦、不愛運動[1-3]；重者體溫升高，食欲廢絕，精神倦怠，嚴重腹瀉，呈水樣常混有血液或膠凍樣黏液，糞便惡臭[4]，腹部觸診有明顯痛疼反應，呈脫水和衰竭狀態及自體中毒癥狀，結膜發紺，脈博細弱，呼吸促迫，常因虛脫而死亡[5-6]。目前，兔腹瀉病在重慶地區有流行趨勢，多發于幼兔，給養兔業造成巨大經濟損失。兔腹瀉病種類多樣，病因復雜，其中，由病原菌導致的細菌性腹瀉最為重要[7]。兔細菌性腹瀉主要包括大腸桿菌病、產氣莢膜梭菌病、泰澤氏菌病、沙門氏菌病、金黃色葡萄球菌病和銅綠假單胞菌病等，其中，以大腸桿菌病和產氣莢膜梭菌病發生率較高[8]。由于兔細菌性腹瀉各病原菌致病性與耐藥性差異，導致其在不同地區呈不同流行趨勢，危害也各有差異，給疫病防控帶來巨大困擾[9]。因此，明確病原、建立有效檢測方法對該病的防控有重要意義。目前，兔細菌性腹瀉的研究主要涉及病原特性和防治措施，有關診斷方法相對較少[10]。傳統病原菌分離鑒定方法費時耗力，成本較高，且易出現漏檢，不能達到快速診斷的目的。本研究對重慶地區兔細菌性腹瀉病原菌進行分離鑒定，并建立檢測方法，為該病的防控奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試 劑

細菌基因組提取試劑盒、2×TaqPCR Master Mix、DL2000 DNA marker、膠回收試劑盒和胎牛血清均購自天根生化科技(北京)有限公司；參照文獻[11]的細菌16S rDNA基因序列通用引物，同時，參照銅綠假單胞菌外毒素eta基因[12]、產氣莢膜梭菌a毒素基因[13]、金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶nuc基因[14]和大腸桿菌外膜蛋白eae基因[15]設計特異性引物，引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物信息見表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2 菌 株

鏈球菌(CVCC1887)、多殺性巴氏桿菌(HN13)和沙門氏菌(ATCC 25922)參考菌株均由重慶市畜牧科學院獸醫獸藥研究所提供。

1.3 病例來源

重慶市各區、縣兔場腹瀉病例的兔糞便或腸道內容物。

1.4 方 法

1.4.1 病原菌分離培養及致病性分析 對疑似感染病例臨床診斷后，采集病料，利用劃線法接種于含有φ=10%胎牛血清的TSA固體培養基，于37 ℃恒溫培養箱中培養，用生理鹽水將分離到的各疑似病原菌菌液稀釋為108cfu·mL-1，通過腹腔注射8只小鼠，每只0.2 mL，并設對照組，正常飼喂7 d后進行致病性分析，并從死亡小鼠心血或肝臟中進行病原菌的分離純化。同時，對分離到的疑似菌株進行革蘭氏染色鑒定。

1.4.2 16S rDNA基因序列擴增及系統進化樹構建 參照細菌基因組提取試劑盒說明書提取分離菌總DNA，利用細菌通用引物擴增各分離菌株16S rDNA基因序列，反應體系為：DNA模板3 μL，上下游引物各0.2 μL，2×TaqPCR Master Mix 25 μL，ddH2O 21.6 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30個循環；72 ℃延伸10 min，PCR產物送上海生工生物工程有限公司進行測序。將測序結果在NCBI 中BLAST比對分析，并借助MEGA 5.0軟件，利用N-J法構建系統進化樹。

1.4.3 多重PCR檢測條件優化 參照“1.4.2”對各菌株特異性引物進行鑒定，PCR產物送上海生工生物工程有限公司測序分析。挑取各病原菌單菌落接種于含φ=10%胎牛血清的TSB培養液，37 ℃培養24 h，用生理鹽水將各菌株稀釋為108cfu·mL-1，提取基因組后，各取2 μL混勻作為模板進行多重PCR反應，參照文獻[11]的方法分別針對引物濃度和退火溫度進行多重PCR反應條件的優化，上下游引物均以0.1 μmol·L-1為濃度梯度，范圍均為0.1～0.5 μmol·L-1，退火溫度以2 ℃為梯度，范圍為50 ℃～60 ℃。

1.4.4 多重PCR引物特異性分析 分別提取參考菌株和病原菌株基因組DNA，利用多重PCR最適反應條件擴增目的基因，進行引物特異性分析。

1.4.5 多重PCR反應靈敏度分析 制備108cfu·mL-1各病原菌菌液，10倍梯度稀釋后，選取濃度為 101～105cfu·mL-1，提取不同濃度病原菌基因組DNA，同一濃度各取2 μL為模板，利用多重PCR最適反應條件進行靈敏度分析。

1.4.6 臨床樣品檢測 利用建立的多重PCR反應條件對臨床采集的樣本進行兔腹瀉病原菌鑒定，并對病原菌多樣性及流行情況進行分析。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀

通過對患病兔的臨床診斷，發現腹瀉病例多為幼兔，腹瀉程度不盡相同(圖1)，且多數病例腸道出血較為嚴重，腸黏膜出現脫落現象(圖2)。

2.2 細菌分離及致病性試驗

通過細菌分離培養共分離到4種疑似病原菌。小鼠攻毒試驗發現，接種12 h后，各試驗組部分小鼠開始出現精神萎靡、采食和飲水減少、蜷縮不動病癥，24 h后開始出現死亡，7 d 后，發現4 種分離菌均可引起小鼠死亡，死亡率分別為60%、80%、100%和50%，且從各死亡小鼠的心血和肝臟中均分離到目的菌株。經革蘭氏染色發現3株為桿狀或短桿菌，1 株為球菌，2 株為G+菌(圖3-B、3-C)，2株為G-菌(圖3-A、3-D)。

2.3 基于16S rDNA的分離菌系統進化樹分析

利用通用引物擴增各分離菌株16S rDNA基因序列，Blast比對發現4種菌株分別與銅綠假單胞菌、產氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌同源性較高，均高于99%，且在系統進化樹分析中也分別與其聚為一簇(圖4)。

圖1 腹瀉幼兔Fig.1 Diarrhea of young rabbit

圖2 腸道病變Fig.2 Intestinal lesion

A～D：細菌分離株1～4(1 000×) Bacterial strain 1-4(1 000×)

圖4 基于16S rDNA基因序列構建的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

2.4 多重PCR反應條件的優化

通過對各菌株特異性引物鑒定，發現均能有效擴增出目的條帶。多重PCR反應條件優化結果顯示：引物濃度≥0.2 μmol·L-1時，鑒定效果較好(圖5)，退火溫度≥58 ℃時效果較好(圖6)，確定0.2 μmol·L-1為最適引物濃度，58 ℃為最適退火溫度。

M.DL2000 marker；1～5. 0.1-0.5 μmol·L-1

M.DL2000 marker；1～6. 50 ℃～60 ℃

2.5 多重PCR檢測的特異性分析

通過對多重PCR引物特異性鑒定，發現各引物僅在有病原菌基因組的情況下可擴增出單一特異性條帶，產物大小與預期結果一致。鏈球菌、多殺性巴氏桿菌和沙門氏菌均無擴增條帶(圖7)。

2.6 多重PCR檢測方法靈敏度分析

通過多重PCR反應體系靈敏度檢測，發現各菌株濃度≥103cfu·mL-1時，擴增效果較好，故該方法的最低檢出濃度為103cfu·mL-1(圖8)。

M.DL2000 marker；1.鏈球菌 Streptococcus;2.多殺性巴氏桿菌 P.multocida；3.沙門氏菌 S.enterica；4.金黃色葡萄球菌 S.aureus；5.銅綠假單胞菌 P.aeruginosa；6.產氣莢膜梭菌 C.perfringens；7.大腸桿菌 E.coli

2.7 臨床樣品檢測

利用建立的檢測方法，對臨床采集的200份兔腹瀉樣品進行檢測，發現混合感染樣品檢出率為37%，單一病原菌感染樣品檢出率為63%。其中，金黃色葡萄球菌單獨感染檢出率高達37.6%，銅綠假單胞菌和產氣莢膜梭菌單獨感染檢出率較低，分別為6.5%和5.0%；混合感染樣品中，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌混合感染檢出率最高(28.0%)，未發現銅綠假單胞菌和產氣莢膜梭菌以及4種病原菌同時感染的樣品，其他病原菌混合感染檢出率均較低(圖9)。

M.DL2000 marker；1～5.101～105 cfu·mL-1

3 討 論

隨著養兔業的不斷發展，兔疫病防控問題已成為主要制約因素。在飼養管理不當、養殖技術水平低的情況下，兔感染病原菌幾率會顯著提高[16]。兔細菌性腹瀉無明顯的季節性，以冬春季節最易流行，發病率和死亡率均較高，多個品種均易發生。此外，兔腹瀉病因復雜，種類多樣，而針對兔細菌性腹瀉的疫苗又相對較少，故快速有效的檢測方法顯得尤為重要[17]。傳統的病原菌分離培養方法雖然能達到疫病診斷目的，但對試驗設備、人員操作和病料采集等方面要求較高[18]。不同病原菌對培養條件的需求往往不一致，當病料中存在多個病原菌時，若在同一條件下進行培養，會出現病原菌間競爭效應，導致培養條件需求較高的病原菌難以分離，給疫病診斷帶來困擾[19]。隨著PCR技術在多個領域的應用，憑借高特異性、高靈敏性、操作簡單等優勢，在疫病診斷方面發揮重要作用。多重PCR技術，不僅具有普通PCR優勢，并能同時對多個目的基因進行檢測，在檢測混合感染方面具有顯著優勢[11]。

圖9 臨床樣本的多重PCR檢測結果統計Fig.9 Multiple PCR test results of clinical samples

目前，關于兔細菌、病毒和寄生蟲等感染引起的疫病檢測研究較多，而混合感染檢測方法相對較少。感染兔的病原菌種類較多，且易與其他病原菌、病毒和寄生蟲發生混合感染，給兔健康養殖帶來嚴重威脅。本研究通過對重慶地區兔腹瀉臨床樣品檢測發現，建立的多重PCR檢測方法能有效針對銅綠假單胞菌、產氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌對兔的感染情況進行診斷，可以通過1次操作實現對病原菌單一或混合感染情況的快速診斷。檢測結果表明，單一病原菌引起的兔腹瀉病例較多，金黃色葡萄球菌檢出率最高，與陳艷會等[20]對葡萄球菌的臨床分離鑒定結果相一致；混合感染多為2種病原菌引起，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌混合感染最為嚴重，未檢出銅綠假單胞菌與產氣莢膜梭菌的混合感染，且未出現4種病原菌同時感染的情況。各病原菌臨床檢出率差別較大，其中，金黃色葡萄球菌單獨感染檢出率為37.6%，混合感染樣品中金黃色葡萄球菌檢出率為81.1%；大腸桿菌單獨檢出率僅為14%，而混合感染樣品中大腸桿菌檢出率高達100%，表明其最易與其他病原菌混合感染，這可能與部分大腸桿菌具有條件致病性有關。

兔細菌性腹瀉病原檢測常采用細菌分離培養技術與分子診斷技術相結合的方法，雖能達到對病原菌鑒定的目的，但耗時較長，對于培養條件要求較高的菌常出現漏檢現象，造成檢測結果誤判，且對多個病原菌混合感染的情況不能達到快速診斷的目的，給疫病防控帶來一定的困擾[19]。本研究建立的多重PCR檢測方法操作簡便，成本低且靈敏度高，給重慶地區兔細菌性腹瀉的檢測提供理論依據，也為該病的防控奠定基礎。