人參皂苷與遠(yuǎn)志皂苷配伍治療大鼠阿爾茨海默病的作用研究

李 卉，張 艷

(1.吉林化工學(xué)院 研究生院，吉林 吉林 132022；2.吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022)

阿爾茨海默病((Alzheimer’s disease，AD)也被稱(chēng)為老年癡呆病，是一種老年人群中常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，主要發(fā)生在人老年前期和老年期[1].記憶力逐漸減退、認(rèn)知功能發(fā)生障礙、行為異常和社交障礙等是AD主要臨床的表現(xiàn)[2，3].目前AD的治療藥物主要為西藥，傳統(tǒng)治療AD的藥物主要是乙酰膽堿酯酶抑制劑，通過(guò)抑制乙酰膽堿酯酶減緩大腦皮層中樞神經(jīng)釋放乙酰膽堿的降解，從而增加乙酰膽堿的濃度，改善AD病人的認(rèn)知功能和行為障礙，延緩疾病的發(fā)生，但臨床治療效果不佳，而使其臨床應(yīng)用受到較大的限制.并且乙酰膽堿酯酶抑制劑僅僅解決了“標(biāo)”的問(wèn)題，沒(méi)有改變“本”，這些藥物僅能在短時(shí)期(6～12個(gè)月)內(nèi)改善AD患者的癥狀(如認(rèn)知能力)，對(duì)患者的日常生活和神經(jīng)精神癥狀(如情感障礙、焦慮、精神變態(tài)等)沒(méi)有顯著的改善.

人參，五加科人參屬植物，我國(guó)的名貴中藥，在中國(guó)、歐洲、東南亞、美洲應(yīng)用廣泛.《神農(nóng)本草經(jīng)》記載“人參，味甘微寒，主補(bǔ)五臟(肝、心、脾、肺、腎)，安精神，定魂魄，止驚悸，除邪氣，明目，開(kāi)心益智”[4,5].遠(yuǎn)志，遠(yuǎn)志科遠(yuǎn)志屬植物，主產(chǎn)與我國(guó)東北、華北、西北和華中以及四川等地.《神農(nóng)本草經(jīng)》記載“遠(yuǎn)志，味苦辛溫，安神益智，解郁，治驚悸，健忘，夢(mèng)遺，失眠，咳嗽多痰，癰疽瘡腫”[6,7].人參、遠(yuǎn)志在防治健忘癥、老年癡呆等老年性疾病方面歷史悠久，古代治療健忘、癡呆的方劑在組成上以補(bǔ)益藥和安神藥為主，補(bǔ)益以補(bǔ)氣為主，補(bǔ)血、補(bǔ)陰為輔，多用人參，安神以養(yǎng)心安神為主，重鎮(zhèn)安神為輔，常用遠(yuǎn)志.將人參與遠(yuǎn)志配伍在古方中極為常見(jiàn)，如定志小丸、開(kāi)心散、人參遠(yuǎn)志散等[8,9].這些方劑均以人參、遠(yuǎn)志為主藥，因此本文人參、遠(yuǎn)志的主要活性成分人參皂苷和遠(yuǎn)志皂苷配伍研究其對(duì)AD模型大鼠的治療作用，既符合古方今用、中藥現(xiàn)代化的要求，又有望為中藥治療AD的藥理及臨床研究提供科學(xué)依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

人參、遠(yuǎn)志皂苷購(gòu)買(mǎi)自吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院.Wistar大鼠，雄性，體重180～220 g，購(gòu)自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK(吉)2017-0003．三氯化鋁(AlCl3)(天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng))；D-半乳糖(上海伊卡生物科技有限公司)；乙酰膽堿酯酶(AchE)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSP-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Morris行為學(xué)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)和被動(dòng)回避性跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)美谷分子有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 AD模型的建立、分組及給藥

1.2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)前24 h，將大鼠放入水迷宮中，自由游泳120 s熟悉環(huán)境，并將其引導(dǎo)站上平臺(tái)10 s，次日進(jìn)行訓(xùn)練.參考文獻(xiàn)方法[10-12]，實(shí)驗(yàn)時(shí)將平臺(tái)藏匿于水面下1 cm，水溫保持在25 ℃左右.將水迷宮等距離設(shè)東、南、西和北4個(gè)標(biāo)記點(diǎn)，作為大鼠進(jìn)入水池的入水點(diǎn)，將水面等分為4個(gè)象限，并將平臺(tái)設(shè)置于第三象限的中間.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)分為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn).定位航行實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠從某一特定象限面向池壁放入水中，記錄120 s內(nèi)大鼠尋找平臺(tái)的軌跡圖、逃避潛伏期.若大鼠120 s內(nèi)未能成功找到平臺(tái)，引導(dǎo)其站上平臺(tái)并停留10 s.空間探索實(shí)驗(yàn)于定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后24 h進(jìn)行，撤除平臺(tái)，重復(fù)試驗(yàn)，記錄120 s內(nèi)大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡、穿越平臺(tái)位置的次數(shù)、在該象限滯留的時(shí)間和路程，用來(lái)反映大鼠空間探索的記憶能力.

1.2.3 大鼠被動(dòng)回避性跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)

跳臺(tái)箱底鋪有鐵柵作為刺激電極，內(nèi)有橡皮墊，作為大鼠回避電刺激的安全平臺(tái).將大鼠放入適應(yīng)5 min，隨后通入36 V交流電，大鼠遭到電刺激后跳上安全平臺(tái)，若從臺(tái)上跳下，接觸鐵柵為錯(cuò)誤反應(yīng)，記錄2 min內(nèi)出現(xiàn)的錯(cuò)誤次數(shù)，24 h后重新實(shí)驗(yàn)，以記錄的潛伏期和出現(xiàn)的錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)來(lái)判斷大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力.

1.2.4 測(cè)定指標(biāo)

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，立即處死大鼠，斷頭取血，分離血清，取腦，制備成10%的腦勻漿.分別按試劑盒方法[13,14]測(cè)定大鼠血清和腦勻漿中AchE、CAT、SOD、GSH-Px活性及MDA含量.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果與討論

2.1 大鼠一般情況的觀(guān)察

與空白組比較，模型組大鼠精神萎靡，毛色黃且無(wú)光澤，活動(dòng)遲緩，進(jìn)食減少；與模型組大鼠比較，治療組大鼠精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，毛色較有光澤，食欲和體重增加，活動(dòng)較為靈活.

2.2 對(duì)AD大鼠空間認(rèn)知能力的影響

記憶力逐漸減退、認(rèn)知功能發(fā)生障礙、行為異常和社交障礙等是阿爾茨海默病主要臨床的表現(xiàn).本文采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)AD大鼠的空間認(rèn)知能力.由圖1可以看出，空白組大鼠很快就可以找到水下平臺(tái)，而模型組大鼠主要在外圍活動(dòng)，活動(dòng)區(qū)域在各象限分布無(wú)顯著差異，表明模型組大鼠產(chǎn)生了嚴(yán)重的空間分辨性障礙.治療組大鼠也可以很快找到水下平臺(tái)，活動(dòng)范圍較模型組相比顯著縮小.與空白組比較，模型組大鼠5 d內(nèi)潛伏期內(nèi)均升高(P<0.05或P<0.01)，平均潛伏期升高.與模型組比較，治療組大鼠5 d內(nèi)潛伏期內(nèi)均降低(P<0.05)，平均潛伏期降低(P<0.05)，見(jiàn)表1.由圖2和表2可以看出，空白組大鼠在平臺(tái)所在象限出現(xiàn)的頻率較多，而模型組大鼠依然主要在外圍活動(dòng)，進(jìn)入有效區(qū)域的運(yùn)動(dòng)時(shí)間、運(yùn)動(dòng)距離及次數(shù)均減少(P<0.05).與模型組比較，治療組大鼠在第三象限出現(xiàn)的頻率較高，進(jìn)入有效區(qū)域的運(yùn)動(dòng)時(shí)間、運(yùn)動(dòng)距離及次數(shù)均增加(P<0.05).以上結(jié)果表明，經(jīng)人參皂苷和遠(yuǎn)志皂苷配伍可以明顯改善AD大鼠嚴(yán)重的空間分辨性障礙，恢復(fù)空間認(rèn)知能力.

圖1 定位巡航實(shí)驗(yàn)軌跡圖

表1 人參皂苷和遠(yuǎn)志皂苷配伍對(duì)AD大鼠定位巡航實(shí)驗(yàn)潛伏期的影響

注：與空白組比較，*p<0.05，**p<0.01；與模型組比較，#p<0.05.

圖2 空間搜索實(shí)驗(yàn)軌跡圖

表2 人參皂苷和遠(yuǎn)志皂苷配伍對(duì)AD大鼠空間搜索實(shí)驗(yàn)的影響

注：與空白組比較，*p<0.05；與模型組比較，#p<0.05

2.3 對(duì)AD大鼠被動(dòng)回避反應(yīng)能力的影響

采用被動(dòng)回避性跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的逃逸潛伏期、錯(cuò)誤次數(shù)，24錯(cuò)誤次數(shù)三項(xiàng)指標(biāo)反應(yīng)AD大鼠被動(dòng)回避反應(yīng)能力，評(píng)價(jià)大鼠的記憶獲得和鞏固能力.如表3所示，與空白組比較，模型組大鼠逃逸潛伏期明顯延長(zhǎng)、跳臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)、24錯(cuò)誤次數(shù)明顯均增加(P<0.05)，表明模型組大鼠記憶獲得和記憶鞏固能力出現(xiàn)了障礙,被動(dòng)回避反應(yīng)能力下降.與模型組比較，治療組大鼠逃逸潛伏期明顯縮短、跳臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)、24錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少(P<0.05)，表明經(jīng)人參皂苷和遠(yuǎn)志皂苷配伍治療后，記憶獲得和記憶鞏固能力有較好的恢復(fù)，能夠改善AD大鼠的被動(dòng)回避反應(yīng)能力.

表3 人參皂苷和遠(yuǎn)志皂苷配伍對(duì)AD大鼠記憶獲得和記憶鞏固障礙的影響

注：與空白組比較，*p<0.05；與模型組比較，#p<0.05

2.4 對(duì)AD大鼠AchE的影響

乙酰膽堿(Ach)是中樞膽堿能系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，其主要的功能是維持意識(shí)的清醒，在學(xué)習(xí)記憶中起著十分重要的作用，并且也特定行為學(xué)反應(yīng)和認(rèn)知活動(dòng)之間有一定聯(lián)系.研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體需要對(duì)新刺激進(jìn)行分析時(shí)，在學(xué)習(xí)和記憶、自發(fā)運(yùn)動(dòng)、空間工作記憶、注意、和探究行為等認(rèn)知活動(dòng)中，基底前腦內(nèi)的膽堿能神經(jīng)元Ach會(huì)被激活.AchE是水解Ach重要的酶，腦內(nèi)細(xì)胞外AchE發(fā)生變化，主要反映在膽堿能神經(jīng)元的活動(dòng)差異.人的腦組織內(nèi)含有大的量AchE，但AchE的活性會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而升高，因此，AchE含量的測(cè)定對(duì)AD的治療十分必要.如表4所示，與空白組比較，模型組大鼠血清、腦組織中AChE活力顯著升高(P<0.05)，治療組AchE活力相比于模型組活性明顯降低并接近空白組(P<0.05)，表明人參皂苷與遠(yuǎn)皂苷志配伍可以通過(guò)抑制Ach活性，減少Ach水解來(lái)改善AD癥狀.

表4 人參皂苷和遠(yuǎn)志皂苷配伍對(duì)AD大鼠AchE活性的影響

注：與空白組比較，*p<0.05；與模型組比較，#p<0.05

2.5 對(duì)AD大鼠抗氧化指標(biāo)的影響

研究發(fā)現(xiàn)，AD患者腦中存在氧化-還原失衡狀況，即自由基產(chǎn)生增加清除減少.SOD是一種源于生命體的活性物質(zhì)，生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，是衰老與死亡的直觀(guān)指標(biāo).GSH-Px可通過(guò)清除·OH等活性氧，減少脂類(lèi)過(guò)氧化，緩解生物膜損傷.脂質(zhì)過(guò)氧化也是細(xì)胞老化的原因之一，預(yù)防脂類(lèi)過(guò)氧化可延緩細(xì)胞老化，所以GSH-Px在預(yù)防衰老方面起到重要作用.CAT可催化合成膽堿能神經(jīng)中的重要遞質(zhì)Ach.研究發(fā)現(xiàn)，AD患者腦中CAT活性降低，AchE活性升高，Ach含量明顯降低，因而CAT水平與記憶能力密不可分.MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生還還能加劇膜的損傷，因此可通過(guò)MDA了水平反應(yīng)細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的程度.如表5、表6所示，與空白組比較，模型組大鼠血清和腦組織中CAT、SOD、GSH-Px活性均降低，MDA含量均顯著升高(P<0.05).與模型組比較，治療組大鼠血清、腦組織中CAT、SOD、GSH-Px活性均升高，MDA含量均顯著降低(P<0.05)，表明人參皂苷和遠(yuǎn)志皂苷配伍可明顯增強(qiáng)AD大鼠的抗氧化能力.

表5 人參遠(yuǎn)志配伍對(duì)阿爾茨海默病大鼠血清中抗氧化指標(biāo)的影響

注：與空白組比較，*p<0.05；與模型組比較，#p<0.05

表6 人參遠(yuǎn)志配伍對(duì)阿爾茨海默病大鼠腦組織中抗氧化指標(biāo)的影響

注：與空白組比較，*p<0.05；與模型組比較，#p<0.05

3 結(jié) 論

人參皂苷和遠(yuǎn)志皂苷配伍可以有效提升AlCl3和D-半乳糖聯(lián)合誘導(dǎo)的AD模型大鼠的空間認(rèn)知能力、記憶獲得和記憶鞏固能力，具有治療AD的作用.其治療AD作用與降低AchE活性和對(duì)抗自由基對(duì)細(xì)胞的損傷引起的氧化損傷有關(guān).