托盤根多糖初步純化及其體外抗氧化活性研究

楊秀東，張嬪妹，張 艷，張 揚，崔 浩，周鴻立

(1.吉林化工學院 化學與制藥工程學院，吉林 吉林 132022；2.吉林化工學院 圖書館，吉林 吉林 132022)

薔薇科懸鉤子屬(Rubus L.)植物在我國傳統中醫藥中具有非常廣泛的應用，本屬植物的入藥部位很多，果實、種子、根及葉均可入藥，具有活血化瘀、祛風除濕、清熱解毒、止血止痛和固腎澀精等作用[1].如覆盆子(R.chingii Hu)的主要化學成分包括皂苷類、黃酮類、甾體和生物堿等，用于治療遺尿尿頻、陽痿早泄、遺精滑精等癥[2].山莓(R.corchorifoliu L.)全株含黃酮、鞣質、香豆素、皂苷等化學成分，具有祛風除濕、消腫解毒、助陽明目、治療腹瀉等功效[3].

托盤根為薔薇科懸鉤子屬植物托盤(RubuscrataegifoliusBunge.)的干燥根.作為傳統中藥，民間用于治療慢性肝炎、風濕性關節炎[4].國內外對托盤根化學成分和藥理作用的研究較少，其醇提物具有抗組織過氧化作用[5,6]，對小鼠肉瘤S180，小鼠艾氏腹水瘤(EAC)，HepA肝癌及Lewis肺癌等腫瘤具有明顯的抑制作用[7,8].同時研究發現托盤根醇提物能夠抑制小鼠蛋清性足腫脹和二甲苯性耳腫脹，并且能夠抑制腹腔毛細血管的通透性，加快消退角叉菜膠引起的足腫脹，減少炎性肉芽腫的增生[9].Sun等還研究了托盤根不同提取物的肝保護作用，發現乙酸乙酯提取物比總提取物和正丁醇提取物具有更強的抗氧化作用和肝保護作用[10].其水煎劑能夠通過增強機體的抗氧化作用，減輕糖尿病引發的脂質過氧化，發揮抗氧化作用，對糖尿病大鼠臟器具有修復作用，促進胰島功能恢復從而發揮其降血糖作用[11].已有報道對托盤根多糖的提取純化、結構鑒定以及粗多糖的α-葡萄糖苷酶的抑制作用進行了報道[12,13]，本研究對托盤根多糖進行了提取、分離和初步純化，并評價純化多糖的體外抗氧化活性，為托盤根多糖的深入研究與開發利用奠定理論基礎.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

托盤根：采集自吉林市郊區，經長春中醫藥大學李勇教授鑒定為薔薇科懸鉤子植物托盤(Rubus crataegiflolius Bunge.)的干燥根.DEAE：大連美侖生物技術有限公司；葡萄糖對照品：天津市北方天醫化學試劑廠；DPPH：上海如吉生藥科技有限公司；2,2′-聯氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、鄰苯三酚、過硫酸鉀：上海晶純生化科技股份有限公司；其他試劑均為分析純.

TU-1810型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；SpectraMax Plus384型酶標儀：美國Molecular Devices公司；RE-3000型旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；KQ-118型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；FA2004N型分析天平：上海精密科學股份有限公司；HH-S型恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市正基儀器有限公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 托盤根多糖的提取

托盤根清洗后置于烘箱干燥至恒重，粉碎，過40目篩.稱取托盤根粗粉250 g，加入2 500 mL水浸泡過夜，加熱回流2 h，提取2次，過濾，合并濾液，濾液減壓濃縮至原體積1/5，加入95%乙醇至醇濃度為80%，于4 ℃靜置過夜，4 000 rpm離心15 min，棄去上清液，得托盤根粗多糖.

1.2.2 托盤根粗多糖的純化

稱取上述處理多糖粉末1 g，配制成0.5 g/mL的水溶液，過濾后加入至DEAE-52層析柱中，依次用水、0.1和0.2 mol/L的NaCl溶液各100 mL洗脫，流速為1.5 mL/min，每6 min收集一個餾分.用苯酚-硫酸法測定多糖含量，繪制洗脫曲線.

1.2.3 多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法測定托盤根樣品中的多糖含量，以標準品葡萄糖為質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，檢測波長為490 nm；以小牛血清白蛋白為對照品，采用考馬斯亮藍法測定樣品中蛋白質含量[14].

1.2.4 體外抗氧化活性實驗

1.2.4.1 DPPH清除率實驗

參照文獻方法[15]，并稍作修改，取托盤根純化多糖RCP-1和RCP-2用純化水配制成不同質量濃度的溶液備用.取樣品溶液100 μL于96孔板中，加入濃度為0.16 mmol/L DPPH甲醇溶液.混合均勻后室溫避光放置30 min，在517 nm下測定吸光度.空白對照用純化水代替樣品溶液，每份樣品平行操作三次.其清除率計算公式如下：

清除率(%)=[A空白-A樣品]/A空白×100

式中：A空白為空白樣品的吸光度，A樣品為測試樣品的吸光度.

1.2.4.2 超氧陰離子自由基清除實驗

超氧陰離子自由基清除能力的測定采用鄰苯三酚自氧化法[16]，并稍作修改.托盤根純化多糖RCP-1和RCP-2用純化水配制成不同質量濃度的溶液備用.取200 μL 50 mmol/L pH=8.2的Tris-HCl緩沖溶液，20 μL不同濃度樣品溶液和20 μL純化水(空白對照)，25 ℃反應20 min.繼續加入20 μL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液，充分振蕩后，在酶標儀中于325 nm處測定1 min和4 min時的吸光度.其清除率計算公式如下：

清除率(%)=[A1-A2]/A1×100

式中A1為鄰苯三酚自氧化率；A2為加入樣品的鄰苯三酚自氧化率.

1.2.4.3 ABTS清除率實驗

清除ABTS自由基的測定是參照文獻[14]方法，并稍作修改.托盤根純化多糖RCP-1和RCP-2用純化水配制成不同質量濃度的溶液備用.取質量濃度7 mmol/L ABTS溶液5 mL，加入88 μL濃度為140 mmol/L的過硫酸鉀溶液混合，在室溫避光條件放置過夜，反應完成后用水稀釋20～40倍，使其在734 nm波長下的吸光度為0.7±0.02，即得到ABTS+工作液.取不同濃度的樣品溶液10 μL于96孔板中，加入190 μL的ABTS+工作液，空白用純化水代替樣品溶液，不同濃度的Vc溶液作為陽性對照.室溫避光放置6 min，于734 nm下測定其吸光度.每份樣品平行操作3次.其清除率計算公式如下：

清除率(%)=[A空白-A樣品]/A空白×100%

式中：A空白為空白樣品的吸光度，A樣品為測試樣品的吸光度.

1.3 數據處理

2 結果與討論

2.1 托盤根多糖的分離純化

采用水提醇沉法提取托盤根多糖，經濃縮干燥后的托盤根粗多糖5.27 g，苯酚-硫酸法測定托盤根粗多糖中多糖含量為14.24%.經Sevage法脫蛋白后，托盤根粗多糖中多糖含量為42.55%，透析后多糖含量為50.64%.上述純化后的托盤根多糖用DEAE-52陰離子交換柱層析純化，得到兩個餾分，分別為水洗脫和0.1 mol/L NaCl溶液洗脫得到，分別命名為RCP-1(20.7 mg)和RCP-2(113.4 mg)，冷凍干燥，兩個純化后多糖為類白色粉末，經測定其多糖含量分別為80.66%和82.15%，且兩個純化多糖中未檢測出蛋白質.

試管號圖1 托盤根多糖的DEAE-52洗脫曲線

2.2 托盤根純化多糖體外抗氧化性活性

2.2.1 托盤根純化多糖對DPPH自由基清除率

DPPH自由基是一種穩定的有機自由基，其在乙醇溶液中具有特征的紫紅色團吸收峰，當存在自由基清除劑時，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其所接受的電子數成定量關系，因而可用分光光度法進行定量分析，是一種快速、簡單、靈敏且可行的評價天然抗氧化劑抗氧化能力的方法.由圖2可知，不同濃度的托盤根純化多糖對DPPH自由基均具有一定的清除作用，隨著樣品濃度的增加，對DPPH自由基清除率越高.在實驗濃度范圍內，RCP-2對DPPH的清除率明顯高于RCP-1.在濃度為0.025,0.05,0.1和0.2 mg/mL時，RCP-2對DPPH的清除率分別為25.35%，31.28%，52.64%和67.88%.

質量濃度/(mg/mL)圖2 托盤根純化多糖對DPPH自由基清除率

注：*表示相同濃度下兩個樣品作用的差異顯著(p<0.05)；圖3，圖4同.

質量濃度/(mg/mL)圖3 托盤根純化多糖對超氧陰離子自由基清除率

質量濃度/(mg/mL)圖4 托盤根純化多糖對ABTS自由基清除率

2.2.2 托盤根純化多糖對超氧陰離子自由基清除率

超氧陰離子自由基可作為多數氧自由基的母體，在生物體內經過一系列反應生成其他自由基.不僅其衍生的自由基會毒性細胞，而且超氧陰離子自由基本身也有毒害作用.由圖4可知托盤根粗多糖對超氧陰離子具有較好的清除作用，其清除率隨濃度增大而增加，且RCP-2對超氧陰離子的清除作用明顯高于RCP-1(p<0.05)，當濃度為0.2 mg/mL時，其清除率達到了68.57%，清除超氧陰離子的IC50值為0.12 mg/mL，而RCP-1的IC50值高于0.2 mg/mL.

2.2.3 托盤根純化多糖對ABTS自由基清除率

ABTS法是基于分光光度法來測定樣品的抗氧化活性，ABTS試劑在氧化劑作用下會形成綠色的ABTS自由基，在抗氧化物存在時ABTS自由基的產生會被抑制.此法具有操作簡單、快速、高通量等優點，是評價天然產物抗氧化活性常用的一種自由基.圖4顯示托盤根純化多糖RCP-1和RCP-2對ABTS自由基的清除作用，兩個多糖在實驗濃度范圍內對ABTS均有一定的清除作用，其清除作用隨實驗濃度的增加而增大，在實驗濃度為0.2 mg/mL時，RCP-1和RCP-2對ABTS的清除率分別為39.03%和58.03%.同時在實驗濃度范圍內，RCP-2對ABTS自由基的清除作用明顯高于RCP-1(p<0.05).

3 結 論

植物多糖是構成生物體的基本物質之一，多有10個以上的單糖分子通過糖苷鍵聚合而成，在有機體中參與多種生命活動.近年來，多糖的化學結構和生物活性研究已經成為生命科學研究中最熱門的領域之一，其在生命過程中的重要生理功能和其廣泛的應用正在不斷被挖掘，是天然藥物和保健品研發中的重要組成部分[17].大量研究表明，天然藥物中的多糖具有顯著的抗氧化活性，多糖類成分能夠清除自由基、提高抗氧化酶的活性以及減少脂質過氧化產物丙二醛的產生，從而表現出多種途徑的抗氧化作用，其抗氧化作用也是其生物活性的作用機制之一[18].本研究采用水提醇沉法對托盤根多糖進行提取，通過Sevage法脫蛋白及透析法進行托盤根多糖的初步純化除雜，最后通過DEAE-52纖維素離子交換柱色譜進行純化，得到了2種較純的托盤根多糖組分.其體外抗氧化活性表明，兩個組分對DPPH、超氧陰離子和ABTS均有較好的清除作用，其中0.1 mol/L NaCl溶液洗脫得到的多糖RCP-2的體外抗氧化活性明顯高于RCP-1.兩個純化多糖的結構還未鑒定和解析，其體外抗氧化活性與分子結構的相關性還需要進一步研究.