陶瓷膜分離技術精制古漢養生精提取液的工藝研究

張可人 張依人 彭買姣 陳葉童 毛文點 鐘源 陽佑華 鄒龍

〔摘要〕 目的 采用陶瓷膜分離技術優化古漢養生精提取液的分離精制工藝，降低生產成本，提高提取液的澄清度。方法 對陶瓷膜孔徑、藥液濃度、溫度進行考察， 以淫羊藿苷轉移率、多糖及蛋白質去除率、浸膏得率為評價指標，通過正交實驗優化古漢養生精提取液的純化工藝。結果 古漢養生精提取液陶瓷膜分離的最佳工藝參數為膜孔徑500 nm、料液比1∶15、溫度25 ℃。在此優化條件下古漢養生精的淫羊藿苷平均轉移率為（92.4±0.6）%，RSD 1.15%；多糖平均去除率（70.4±0.7）%，RSD 1.26%；蛋白平均去除率（23.5±0.2）%，RSD 1.30%；浸膏平均得率（17.6±0.2）%，RSD 1.50%；綜合評分0.1837。結論 采用陶瓷膜技術精制古漢養生精提取液工藝穩定可行，可為古漢養生生精工業化生產技術優化提供科學依據。

〔關鍵詞〕 古漢養生精口服液；陶瓷膜；淫羊藿苷

〔中圖分類號〕R284.2 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.08.008

〔Abstract〕 Objective To investigatethe separation and purification processof ancient Han health-keeping extract by ceramic membrane separation technique， in order to reduce production costs and improve the clarity of this extract. Methods The pore size of ceramic membrane， solid-liquid ratio， and temperature were analyzed， and with the transferring rate of icariin， removal efficiency of polysaccharides and protein， and extract yield as assessment indices， an orthogonal experiment was performed to optimize the purification process for ancient Han health-keeping extract. Results The optimal process parameters for ceramic membrane separation for ancient Han health-keeping extractwere a membrane pore size of 500 nm， a solid-liquid ratio of 1：15， and a temperature of 25 °C. Under these optimized conditions， the mean transferring rate of icariin was （92.4±0.6）% （RSD=1.15%）， the mean removal efficiencies of polysaccharides and protein were （70.4±0.7）% （RSD=1.26%） and （23.5±0.2）% （RSD=1.30%）， respectively， and the mean extract yield was （17.6±0.2）% （RSD=1.50%）； the comprehensive score was 0.1837. Conclusion Ceramic membrane separation technique is stable and feasible in the preparation of ancient Han health-keeping extract and provides a scientific basis for the optimization of industrial production technique for ancient Han health-keeping extract.

〔Keywords〕 ancient Han health-keeping extract oral liquid； ceramic membrane； icariin

古漢養生精口服液由淫羊藿、人參、黃芪、枸杞、女貞子、黃精等藥材組成，具有補氣、滋腎益精，補腦安神之效，可用于氣陰虧虛、腎精不足所致的失眠、耳鳴、心悸、健忘等[1-2]。

目前，醇沉法是古漢養精口服使用的純化工藝，主要是利用中藥的部分有效成分既溶于醇又溶于水的性質，除去部分不溶于乙醇的成分如蛋白質、多糖等，以達到去除雜質，提高藥液澄明度的目的[3]。但是醇沉工藝成本高、效率低，甚至會造成某些水溶性小的有效成分的損失，影響藥物療效[4]，因此，利用新型分離純化技術提高古漢養生精口服液產品質量顯得尤為重要。

陶瓷膜分離技術憑借其節能環保、操作簡單、分離效果好等特點，在制藥行業中具有一定的優勢。陶瓷膜分離技術是以選擇性透過膜為分離介質，當膜兩側存在壓力差時，原料組分選擇性的透過膜，從而達到分離、提純的目的。整個過濾過程，不涉及任何化學反應，無需添加任何化學試劑，陶瓷膜憑借膜孔徑的大小，截留分子量不同的物質，比如多糖、蛋白質、鞣質等雜質，對有效成分影響小，生產成本低。本課題運用陶瓷膜分離技術精制古漢養生精提取液，研究報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

戴安U3000型高效液相色譜儀（美國戴安公司）；

Lambda35型紫外分光光度儀（珀金埃爾儀器有限公司）；BP221S型電子分析天平（賽多利斯儀器公司）；WMK-O2型恒溫干燥箱（湖北省黃石市醫療器械廠）；DL-360D型超聲機（上海之信儀器有限公司）；陶瓷膜分離裝置（湖州東潤環保設備有限公司）。

1.2 材料

淫羊藿苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110737-200415）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純；水為純化水。

古漢養生精提取液所用的人參（Panax ginseng C. A. Mey.）、炙黃芪（Astragalus membranaceus （Fisch.） Bge.）、金櫻子（Rosa laevigata Michx.）、枸杞子（Lycium barbarum L.）、女貞子（Ligustrum lucidum Ait.）、菟絲子（Cuscuta australis R. Br.）、淫羊藿（Epimedium brevicornu Maxim.）、白芍（paeonia lactiflora Pall.）、炙甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、炒麥芽（Hordeurm vulgare L.）、黃精（Polygonatum sibiricum Red.），經湖南中醫藥大學鄒龍教授鑒定均符合《中華人民共和國藥典》2015年版一部相關藥材項下的有關規定[5]，藥材均購于安國圣山藥業有限公司。

2 方法與結果

2.1 陶瓷膜分離操作

在物料桶中加入30 L經高速離心后的古漢養生精提取液（因屬于中藥保護品種，所制制備工藝暫未公開），用不同孔徑的膜在不同操作參數下進行分離，收集透過液。當透過液收集到80%時，在物料桶中加入20%的純化水，繼續分離，透過液接到100%后停止。

2.2 淫羊藿含量的測定

2.2.1 色譜條件[5] 色譜柱（Agilent C18，4.6 mm×150 mm，5 μm），以乙腈-水（30∶70）為流動相，檢測波長為270 nm，進樣量為10 μL，流速1 mL/min。此色譜條件下，淫羊藿苷可與其他成分達到較好分離，陰性無干擾。供試品與對照品的色譜圖見圖1。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密吸取藥液5 mL，置于 50 mL容量瓶中，加甲醇40 mL，超聲處理30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性溶液的制備 按處方取除去淫羊藿藥材外的10味藥材，按其制備工藝制備，再按“2.2.2”項下方法處理，即得。

2.2.4 線性關系 精密稱取淫羊藿苷對照品適量，加甲醇溶解制成1 mL含100 μg的對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液1、2、3、4、5、10 mL于25 mL容量瓶，加甲醇至刻度，搖勻。按“2.2.1”項下色譜條件測定淫羊藿苷峰面積。以淫羊藿苷峰面積值（Y）為縱坐標，淫羊藿苷濃度（X）為橫坐標進行回歸，回歸方程為Y=0.376 X-0.217 4，相關系數r=0.999 1。表明，淫羊藿苷在4～40 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.5 樣品測定 精密吸取“2.2.2”項下供試品液10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件測定淫羊藿苷峰面積，按下式計算淫羊藿苷轉移率。

2.3 多糖含量的測定

2.3.1 對照品溶液的配制 精密稱取D-無水葡萄糖0.011 4 g置于100 mL容量瓶中，加純化水溶解并稀釋至刻度，搖勻得114 μg/mL的多糖對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液配制 取原藥液、陶瓷膜透過液各1 mL，加無水乙醇4 mL，混勻，離心（3 000 r/min） 5 min，棄去上清液，沉淀用8 mL的80%乙醇洗滌，離心10 min，洗滌2次，棄去洗液，殘渣用沸水多次提取，合并提取液轉移至25 mL容量瓶中并定容，即得供試品溶液。

2.3.3 線性關系考察 取對照品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL具塞試管中，加入蒸餾水補至 2 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，放置10 min，再置40 ℃水浴中15 min，取出，置于冰水中5 min至室溫，于490 nm波長處測定吸光度。以吸光度（Y）為縱坐標，D-無水葡萄糖濃度（X）為橫坐標建立標準曲線[6-8]。

回歸方程：Y=0.014 8 X+0.019 2，r=0.995 9

表明多糖在5.7～57 μg/mL的濃度范圍內與吸光度Y線性關系良好。

2.3.4 樣品測定 取原藥液、陶瓷膜透過液的供試品溶液1 mL，按“2.3.3”項下操作同法制備，測吸光度，將測得的吸光度代入回歸方程計算待測溶液中多糖的濃度。按下式計算多糖的去除率。

2.4 蛋白質含量的測定

蛋白質的含量測定使用蛋白質定量測定試劑盒，具體操作步驟如下。

2.4.1 考馬斯亮藍染液的配制 取蛋白質定量測定試劑盒中的考馬斯亮藍儲備液10 mL于50 mL容量瓶中，加40 mL的純化水稀釋，搖勻得考馬斯亮藍染液。

2.4.2 樣品測定 在空白管中加入50 μL的純化水、在標準管中加入蛋白質定量測定試劑盒中的563 μg/mL蛋白質標準品溶液、在樣品管中加入50 μL的原藥液或陶瓷膜透過液，最后在空白管、標準管、樣品管中均加入3 mL的考馬斯亮藍染液，混勻，靜置10 min，于595 nm波長處測定各管吸光度值。按下式分別計算樣品管中蛋白質濃度和蛋白質去除率。

2.5 浸膏得率

取50 mL陶瓷膜透過液，置于已恒重的蒸發皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃中干燥3 h，再移至于干燥器中，冷卻30 min。迅速精密稱定質量，計算干浸膏得率。

2.6 古漢養生精陶瓷膜分離工藝的研究

2.6.1 指標數據的處理 以淫羊藿苷轉移率、多糖去除率、蛋白質去除率、浸膏得率為指標，對4個指標進行歸一化處理[9-10]。淫羊藿苷轉移率、多糖去除率、蛋白質去除率的值越大越好，其歸一化方程是：

按歸一化方程得出各指標的歸一值后，再以權重系數綜合評分法評價，淫羊藿苷轉移率、多糖去除率、蛋白質去除率、浸膏得率的權重系數分別是0.7、0.1、0.1、0.1。

2.6.2 陶瓷膜分離工藝的優化 參照文獻[12-14]及預實驗結果，選擇陶瓷膜孔徑、藥液濃度、溫度進行優化，采用三因素三水平的正交設計，用L9（34）正交表安排試驗，以淫羊藿苷轉移率、多糖去除率、蛋白質去除率、浸膏得率的綜合評分為指標，所選因素及其水平見表1。由表2極差分析可知，各因素對古漢養生精提取影響的大小順序是：A>B>C，即膜孔徑>濃度>溫度。表3方差分析結果表明A（膜孔徑）和B（濃度）對結果的影響具有顯著性意義（P<0.05），C（溫度）對結果的影響沒有顯著性意義（P>0.05），因此，從經濟學角度考慮，最佳分離純化工藝為A3B2C1，即陶瓷膜孔徑為500 nm，料液比1∶15，溫度25 ℃。

2.6.3 驗證實驗 為了考察工藝的穩定性與可靠性，按正交設計優選出來的最優工藝陶瓷膜孔徑為500 nm，料液比1∶15，溫度25 ℃平行進行3次驗證試驗，結果無顯著差異，測定淫羊藿苷平均轉移率為（92.4±0.6）%，多糖平均去除率（70.4±0.7）%，蛋白平均去除率（23.5±0.2）%，浸膏平均得率（17.6±0.2）%，4個指標的RSD分別為1.15%、1.26%、1.30%、1.50%，綜合評分0.183 7，表明優選的工藝基本可靠。

3 結論與討論

本實驗通過正交設計對精制古漢養生精提取液的膜孔徑、料液比、溫度3個因素進行考察，確定了最佳工藝為：膜孔徑500 nm、料液比1∶15、溫度25 ℃。驗證實驗結果表明優選的工藝穩定、可行。

采用多指標正交實驗進行工藝優選，以權重系數綜合評分法評價，對各指標歸一化后再分別賦予不同的權重系數。在追求除雜效果的同時，要保證有效成分的轉移率，故將淫羊藿苷轉移率、多糖去除率、蛋白質去除率、浸膏得率的權重系數分別設為0.7、0.1、0.1、0.1，其優選工藝更符合實際生產。

本實驗使用陶瓷膜分離技術精制古漢養生精提取液，代替傳統醇沉工藝，操作簡單，可避免大量使用乙醇，降低生產成本。通過該技術所得到的提取液其澄明度和穩定性都有明顯的改善，我們計劃將這一生產技術應用于古漢養生精的工業化生產中去，此項實驗目前正在進行中。

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