UPLC—MS/MS法同時測定通關藤藥材中3種皂苷的含量

王祁民 安靜 李穎 馬銀玲 董占軍

中圖分類號 R28 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）08-1048-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.08.09

摘 要 目的：建立同時測定通關藤藥材中通關藤苷A、H、I含量的方法。方法：采用超高效液相色譜-串聯質譜法，色譜柱為Phenomenex Kinetex XB-C18，流動相為0.1%甲酸溶液-乙腈（梯度洗脫）， 流速為 0.2 mL/min，柱溫為40 ℃，進樣量為5 μL，離子源為電噴霧離子源，多反應離子監測模式，正離子掃描，離子源噴射電壓為5 500 V，霧化氣壓力為60 psi，加熱氣壓力為60 psi，簾氣壓力為20 psi，去溶劑溫度為600 ℃。結果：通關藤苷A、H、I檢測質量濃度線性范圍分別為0.1～10 ng/mL（r=0.999 7）、0.025～10 ng/mL（r=0.999 5）、0.025～10 ng/mL（r=0.998 9）；定量限分別為0.1、0.025、0.025 ng/mL，檢測險分別為0.05、0.012 5、0.012 5 ng/mL；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD均小于4.0%；加樣回收率分別為97.67%～99.00%（RSD=0.47%，n=6）、95.00%～101.67%（RSD=2.59%，n=6）、96.67%～103.33%（RSD=2.83%，n=6）。結論：該方法操作簡便，精密度、穩定性、重復性好，可用于通關藤藥材中通關藤苷A、H、I含量的同時測定。

關鍵詞 通關藤；通關藤苷A；通關藤苷H；通關藤苷I；超高效液相色譜-串聯質譜法

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for simultaneous determination of tenacissoside A， tenacissoside H and tenacissoside I in Marsdenia tenacissima. METHODS： UPLC-MS/MS method was adopted. The determination was performed on a Phenomenex Kinetex XB-C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid solution-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 0.2 mL/min. The column temperature was set at 40 ℃， and sample size was 5 μL. Multiple reaction monitoring （MRM） mode was adopted with electrospray ion source as ion source， using positive ion scanning. Source jet voltage was 5 500 V， nebulizer pressure was 60 psi， heating pressure was 60 psi， curtain pressure was 20 psi and cone temp was set at 600 ℃. RESULTS： The linear ranges of tenacissoside A， tenacissoside H and tenacissoside I were 0.1-10 ng/mL （r=0.999 7）， 0.025-10 ng/mL（r=0.999 5）， 0.025-10 ng/mL（r=0.998 9）， respectively； limited of quantation were 0.1，0.025，0.025 ng/mL，limited of detection were 0.05，0.012 5，0.012 5 ng/mL， respectively； RSDs of precision， stability and reproducibility tests were<4.0%. The recoveries were 97.67%-99.00%（RSD=0.47%，n=6）， 95.00%-101.67%（RSD=2.59%，n=6）， 96.67%-103.33%（RSD=2.83%，n=6）. CONCLUSIONS： The method is simple， precise， stable and reproducible， and can be used for simultaneous determination of tenacissoside A， tenacissoside H and tenacissoside I in M. tenacissima.

KEYWORDS Marsdenia tenacissima； Tenacissoside A； Tenacissoside H； Tenacissoside I； UPLC-MS/MS

通關藤[Marsdenia tenacissima（Roxb.） Wight et Arn.]又名烏骨藤、通光藤、通關散、奶漿藤等，收載于2015年版《中國藥典》（一部），分布于我國云南、貴州等地，入藥部位為其干燥藤莖，有止咳平喘、祛痰、通乳、清熱解毒等功效[1-3]?，F有文獻報道多集中于通關藤藥材中酚酸類物質[4-7]，近期研究顯示通關藤藥材主要活性成分為甾體皂苷類化合物[3]。2015年版《中國藥典》（一部）中通關藤藥材的含量測定項是以通關藤苷H為指標成分，采用高效液相色譜法（HPLC）進行檢測的。隨著對該藥材研究的不斷深入，鑒定分離的通關藤苷種數不斷增加[2-3]，有文獻報道了采用HPLC法測定通關藤藥材及其制劑中通關藤苷的方法[8-10]。本試驗采用超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）建立同時測定通關藤藥材中通關藤苷A、H、I含量的方法，以期為更好地對該藥材進行質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UPLC-30A型UPLC系統（日本Shimadzu公司）； AB Sciex Triple QuadTM 5500 型串聯四極桿線性離子阱MS儀（美國Sciex公司）；AB204-S型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ3200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

通關藤苷A對照品（山西省中醫藥研究院，批號：20130513，純度：>98.3%）；通關藤苷H對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111913-201202，純度：>98%）；通關藤苷I對照品（深圳遠揚生物技術有限公司，批號：20160311，純度：>98%）；乙腈、甲醇、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

通關藤藥材 （國藥樂仁堂石家莊藥材有限公司，批號：160132、160320、160521，產地：云南）經河北省人民醫院藥學部董占軍主任藥師鑒定為真品。

2 方法與結果

2.1 試驗條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Kinetex XB-C18（50 mm×2.1 mm， 2.6 μm）；流動相：0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～1 min，40%B；1～2 min，40%B→90%B；2～4 min，90%B；4～4.01 min，90%B→40%B；4.01～6 min，40%B）；流速：0.2 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。

2.1.2 質譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI）；多反應離子監測模式（MRM），正離子掃描；離子源噴射電壓：5 500 V；霧化氣（gas 1）壓力：60 psi；加熱氣（gas 2）壓力：60 psi；簾氣壓力：20 psi；去溶劑溫度：600 ℃；其余質譜分析參數見表1（表中DP為解簇電壓，CE為碰撞能量）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取待測成分對照品各適量，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，得通關藤苷A、H、I質量濃度均為1 mg/mL的單一對照品貯備液，于 4 ℃貯藏，備用。精密量取上述單一對照品貯備液各10 μL，分別置于量瓶中，加甲醇定容至1 mL，得通關藤苷A、H、I質量濃度均為10 μg/mL的單一對照品溶液。精密量取上述單一對照品溶液各適量，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，得通關藤苷A、H、I質量濃度均為100 ng/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取藥材樣品粉末（過3號篩）1.006 g，置于錐形瓶中，加甲醇40 mL，稱定質量，密塞，超聲（功率：120 W，頻率：40 kHz）處理25 min，冷卻，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，得供試品溶液Ⅰ；精密量取上述供試品溶液Ⅰ10 μL，置于量瓶中，加甲醇稀釋并定容至200 mL，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 缺藥材樣品，按“2.2.2”項下方法操作，得陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗

精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各5 μL，按“2.1”項下試驗條件進樣測定。結果表明，各待測成分出峰時間穩定，峰形良好，陰性對照無干擾，色譜見圖1。

2.4 線性關系考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液各適量，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，制成通關藤苷A、H、I質量濃度均為10、8、4、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.025 ng/mL的系列混合對照品溶液。精密量取上述系列混合對照品溶液各5 μL，按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。以通關藤苷A、H、I質量濃度（x，ng/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸?；貧w方程與線性范圍見表2。

2.5 定量限與檢測限考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.1”項下試驗條件進樣測定，當信噪比為10 ∶ 1時，得定量限；當信噪比為3 ∶ 1時，得檢測限，詳見表2。

2.6 精密度試驗

取“2.4”項下質量濃度為1 ng/mL混合對照品溶液適量， 按“2.1”項下試驗條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，通關藤苷 A、H、I峰面積的RSD分別為2.46%、1.53%、3.22%（n=6），表明日內精密度良好。按“2.1”項下試驗條件連續測定3 d，記錄峰面積。結果，通關藤苷 A、H、I峰面積的RSD分別為3.26%、2.67%、3.81%（n=6），表明日間精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：160132）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。結果，通關藤苷A、H、I峰面積的RSD分別為3.83%、1.51%、2.85%（n=6），表明供試品溶液室溫放置24 h內基本穩定。

2.8 重復性試驗

精密稱取藥材樣品（批號：160132）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果，通關藤苷A、H、I含量平均值分別為6.35、1.27、0.62 mg/g，RSD分別為 3.16%、3.74%、2.71%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量樣品（批號：160132）適量，每份0.5 g，共6份，分別加入一定質量的待測成分對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表3。

2.10 耐用性試驗

2.10.1 色譜柱考察 取藥材藥品（批號：160132）質量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件[色譜柱分別為Phenomenex Kinetex XB-C18（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）、Accucore C18（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）、 Cosmocore C18（50 mm×2.1 mm， 2.6 μm）]進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，詳見表4。結果表明，本試驗條件在一定色譜柱變動情況下耐用。

2.10.2 流動相考察 取藥材藥品（批號：160132）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件（流動相中甲酸溶液體積分數分別為0.05%、0.15%、0.20%）進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，詳見表4。結果表明，本試驗條件在一定流動相變動情況下耐用。

2.10.3 流速考察 取藥材藥品（批號：160132）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件（流速分別為0.15、0.20、0.25 mL/min ）進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，詳見表4。結果表明，本試驗條件在一定流速變動情況下耐用。

2.10.4 柱溫考察 取藥材藥品（批號：160132）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件（柱溫別為25、30、35 ℃）進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，詳見表4。結果表明，本試驗條件在一定柱溫變動情況下耐用。

2.11 藥材樣品含量測定

取3批藥材樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并計算藥材樣品含量，結果見表5。

3 討論

通關藤藥材及其制劑在臨床上應用日益廣泛，但缺乏其質量控制的相關標準，通關藤藥材含多種成分，包括酚酸類、C21甾體皂苷類、甾醇/環醇類、多糖類、三萜類化合物等[3]。以前文獻多報道其酚酸類成分[4-7]，但酚酸類物質存在于多種中藥材中，特異性不強；近年研究顯示，C21甾體皂苷是通關藤的主要活性成分，目前從通關藤藥材中提取的通關藤苷就超過50種[11-12]。因此，有必要建立以多種通關藤苷含量為指標的質量控制標準，本研究在2015年版《中國藥典》（一部）基礎上，又選擇了含量較高的通關藤苷A和I[9-10]作為檢測指標。

通關藤苷A、I屬于甾體皂苷類，是一類苷元為孕甾烷衍生物與2-脫氧糖等形成的苷，在紫外光譜末端有吸收，因此多數文獻[8-10]報道采用 HPLC法對甾體皂苷類進行測定，但是采用末端吸收波長會受到較大干擾；且由于通關藤苷H沒有紫外吸收，所以不能和其他成分同時檢測。另一方面，中藥成分復雜，采用HPLC法分析干擾較大，為達到合格的分離度，往往分析時間很長（>0.5 h）。本研究采用UPLC-MS/MS技術，MRM模式，通過對色譜條件及質譜條件的優化，6 min內完成了對通關藤苷A、H、I的同時測定，操作簡便，精密度、穩定性、重復性好，為通關藤藥材的質量控制提供了一定供鑒。

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（收稿日期：2017-07-05 修回日期：2017-09-12）

（編輯：張 靜）