苓桂劑調節固有免疫治療青春期尋常型痤瘡

袁玉亮 朱瑞麗 孫士鵬 魏華民

摘要目的：觀察苓桂劑治療青春期尋常型痤瘡的臨床療效，并從免疫調節方面探討其可能的機制。方法：選取2016年3月至2017年11月中國中醫科學院廣安門醫院南區收治的青年期尋常型痤瘡患者62例作為觀察組以及同時期健康志愿者20例作為對照組，苓桂劑治療10 d后評估臨床有效率并用流式細胞儀分析治療前后患者外周血的CD14+TLR2+及ELISA法檢測IL4、IL8、TNFα和COX2水平。結果：所有患者均不同程度緩解，CD14+TLR+在正常組、治療前、治療后分別為為（78±5）%、（923±67）%、（812±46）%，治療后較治療前下降明顯（P=0044），IL4、IL8、TNFα和COX2水平治療后亦顯著下降（P<005）。結論：苓桂劑可能通過調節固有免疫途徑改善青春期尋常型痤瘡。

關鍵詞青年期尋常型痤瘡；苓桂劑；Toll樣受體；固有免疫調節

Effects of Linggui Prescription on Adolescent Acne Vulgaris Through Innate Immunity Regulation

Yuan Yuliang1， Zhu Ruili1， Sun Shipeng1， Wei Huamin2

（1 Guang′anmen Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 102618， China； 2 Beijing Friendship Hospital， Capital Medical University， Beijing 100050， China）

AbstractObjective：To observe the clinical effects of Linggui prescription on adolescent acne vulgaris， and investigate the possible mechanism of it on immune regulation. Methods：Sixtytwo cases of adolescent acne vulgaris and 20 healthy cases were involved in the study. After 10 days of Chinese herbal treatment， clinical efficient was evaluated， and also rate of CD14+TLR2+ and level of IL4， IL8， TNFα and COX2 were detected in peripheral blood by Flow Cytometer and ELISA. Results：All cases had a clinical remission in different degree， rate of CD14+TLR+ in healthy control， pretreatment and aftertreatment group were （78±5）%， （923±67）%， （812±46）%. The rate had a significant decrease in aftertreatment v.s. pretreatment （P=0044）， level of IL4， IL8， TNFα and COX2 were also markedly decreased after treatment （P<005）. Conclusion：Linggui prescription might improve adolescent acne vulgaris through innate immunity regulation.

Key WordsAdolescent acne vulgaris； Linggui Prescription； Tolllike receptor； Innate immunity regulation

中圖分類號：R2759文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.07.012

尋常型痤瘡是青少年多發的一種皮膚病，也是中醫治療的優勢病種之一。既往中醫前輩根據時代特點，多用調和營衛、祛風利濕止癢、排膿解毒消癰的藥物[13]，但根據中醫辨證思想，不同時代的人體質差異有統計學意義，導致相應的治療方法不斷發生演變。根據筆者觀察，現代的青年人，具有類似的生活習慣，如運動少，喜冷食、辣食，多吹冷空調，飲料喝的較多等，這些共同的不良習慣導致了該群體的青年人存在一個共同的體質傾向即：營衛失調、痰濕內盛，具體表現為容易感冒或反復發生鼻炎、咽炎，舌體胖大多有齒痕，手足易冷，面色多青暗，痤瘡多表現為色暗、灰滯等，這些不僅反映了榮衛郁滯、寒邪傷陽的病機，也對治療提出了新的要求，應用既往的涼血解毒藥為主的治療方法可能不能滿足此類人群的需要[46]。針對新的辨證變化，結合既往中醫研究的成果，我們提出應用苓桂劑為主的方藥治療此類痤瘡，臨床效果滿意，為明確其可能的機制，本研究結合現代醫學的檢驗方法，對苓桂劑治療青春期尋常型痤瘡進行了新的機制探索。現將研究結果報道如下。

1資料與方法

11一般資料選取2016年3月至2017年11月中國中醫科學院廣安門醫院南區收治的青年期尋常型痤瘡患者62例作為觀察組以及同時期健康志愿者20例作為對照組，均簽署知情同意書，本研究采用前后對照的方法，分別于患者入組前后收集患者的臨床資料：包括患者一般資料（性別、年齡等）、皮損程度、不良反應等；另外于患者前后清晨采集肘靜脈血5 mL，低溫（4 ℃）離心15 min（2 500 r/min），吸取上清液，置于-20 ℃冰箱保存備用。本研究經中國中醫科學院廣安門醫院倫理委員會審查批準（審批號：2015EC05603）。

12診斷標準參照《中國臨床皮膚病學》（趙辨，江蘇鳳凰科學技術出版社，2009年12月第1版）中診斷標準：以毛囊性丘疹、黑頭粉刺、膿皰、結節、囊腫和瘢痕為主要皮損表現，伴有皮脂溢出，好發于面部、上胸及背部，呈對稱分布、慢性經過。參照Pillsbury及國際改良痤瘡分級法進行臨床分級：I級：主要皮損為散發至多發黑頭粉刺，可伴發炎性丘疹，總病灶數10～30個；II級：主要皮損為粉刺，并有中等數量的丘疹和潛在性膿皰，局限在面部，總病灶數31～50個；III級：主要皮損為炎性丘疹和膿皰，可見深在性膿皰和大的炎性皮損，發生與顏面、頸部、胸背部，總病灶數50～100個，結節/囊腫<3個。IV級：大量的丘疹和膿皰，結節、囊腫，伴瘢痕形成，發生于上半身總病灶數>100個，結節/囊腫>3個。

13納入標準1）符合上述診斷標準；2）年齡處于青春期即10～20歲。3）主要癥狀除痤瘡外多有容易感冒或反復發生鼻炎、咽炎，舌體胖大多有齒痕，手足易冷，面色多青暗，痤瘡多表現為色暗、灰滯等。

14排除標準1）舌苔黃或黃膩者；2）面部油膩光亮，口臭，尿赤，便秘者；3）伴有明顯的心煩易怒、胸脅脹痛者；4）伴有口干、五心煩熱、失眠多夢、舌紅少苔、脈細者。5）伴有嚴重的先天性疾病和慢性病者。6）對中藥有過敏史者。

15脫落與剔除標準1）患者失訪；2）患者主動撤回知情同意書；3）患者未按規定用藥致使療效評估受影響者。

16治療方法對所有患者進行告知，主要包括以下內容：1）避免受風寒，尤其是以汗后為主；2）避免辛辣、生冷、油膩食物及大量飲水；3）避免作息不規律，尤其是熬夜，長期面對電腦、手機等電子產品。除滿足以上條件外，每名入組患者均需每日煎服苓桂劑：桂枝9 g、白芍9 g、生姜9 g、大棗12 g、炙甘草6 g、茯苓12 g、白術12 g。熱重加黃芩10 g，1劑/d，水煎服，10劑為1個療程。

17觀察指標

171外周血CD14+細胞染色及檢測CD14FITC抗體、IgG1FITC抗體、IgG2aPE抗體、TLR2PE抗體購自于美國BD公司（產品批號分別為557153，550616，562302，565349），分別于流式管底部加入相應抗體2 μL，加入抗凝血100 μL，震蕩混勻，室溫避光孵育20 min；加入2 mL溶血素（美國BD公司）震蕩混勻，室溫避光5 min后1 300 r/min離心10 min；棄上清，加入2 mL PBS震蕩混勻后1 300 r/min離心10 min；重復以上過程；用BECKMAN COULTER流式細胞檢測儀檢測外周血中CD14+TLR2+細胞的陽性率。

172外周血中炎性反應因子的水平采用雙抗夾心ELISA法測定患者治療前后血清白細胞介素4（IL4）、白細胞介素8（IL8）、腫瘤壞死因子α（TNFα）和環氧合酶2（COX2）的變化（試劑盒購于美國Abcam公司），按照說明書進行檢測。簡述步驟如下：1）按說明進行標準品的稀釋；2）加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步驟操作相同）、待測樣品孔；3）溫育：用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min；4）配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。5）洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。6）加酶：每孔加入酶標試劑50 μL，空白孔除外。7）溫育：操作同3）；8）洗滌：操作同5）；9）顯色：每孔先加入顯色劑A50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。10）終止及測定：每孔加終止液50 μL，終止反應（此時藍色立轉黃色）。測定：以空白孔凋零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應加在終止液后15 min以內進行。

18療效判定標準根據患者皮損情況予以評分分級I級皮損評分為1～3分，II級皮損評分為4～6分，III級皮損評分為7～9分，IV級皮損評分為10～12分，由3位醫師共同評分，取平均值作為患者評分等級。按照評分情況進行療效評估：療效指數=（治療前評分-治療后評分）/治療前評分×100%，無效：療效指數<20%；有效：療效指數21%～60%；顯效：療效指數61%～95%；治愈：療效指數>96%。

19統計學方法采用SPSS 200統計軟件進行統計分析，資料描述數據采用均數±標準差（±s）的形式表示，治療前后數據采用組內t檢驗，以P<005為差異有統計學意義。

2結果

212組臨床療效比較觀察組患者治療前后皮損分數分別為（67±21）分和（16±04）分，差異有統計學意義（P=0023）。經過治療后無效0例，有效14例，顯效25例，治愈23例。

22對照組及觀察組患者外周血CD14+單核細胞TLR2分析見圖1。

23對照組及觀察組外周血血清IL4、IL8、TNFα和COX2水平將2組人群外周血同時檢測，結果如下，觀察組較對照組組IL8及COX2均明顯升高，差異有統計學意義（P<005），經治療后較治療前水平顯著下降，差異有統計學意義（P<005）。

3討論

目前公認的痤瘡病因是丙酸桿菌感染，由其激活的炎性反應是痤瘡的起始和加重環節。目前的研究認為在該病原體入侵機體后，與固有免疫細胞表面的識別受體相結合，激活效應細胞，啟動一系列免疫反應是痤瘡發展的根本原因。Toll樣受體是一類重要的模式識別受體，在生物界中廣泛存在，是固有免疫系統的重要組成之一，在機體固有免疫中發揮重要的抗感染作用，主要通過TLR2和TLR4識別許多病原微生物及分枝桿菌產物，激活核因子而促進多種炎性因子、黏附分子及抗微生物肽的轉錄表達。和痤瘡相關的主要受體為TLR2[79]。TLR2是一種參與免疫應答的跨膜非催化性蛋白質分子，在機體皮膚、黏膜等物理屏障受損是激活免疫調節系統的重要分子[10]，通過細胞內信號通路誘導IL8、IL4及TNFα聚集并使COX2表達增加，促進炎性反應[1113]。近期的研究證實，上述炎性反應因子和痤瘡的嚴重程度密切相關，可作為痤瘡治療評估的客觀標準[14]。

通過中藥調節痤瘡患者的固有免疫減緩炎性反應是本研究的主要內容。通過補法治療痤瘡文獻少有報道，這也是本研究重要的創新點之一，我們前期通過臨床觀察發現青春期痤瘡患者的體質多數屬于濕盛陽傷、營衛失調類型，基于該類患者的體質類型，我們試用桂枝湯聯合苓桂術甘湯，并在本實驗中證實：以調補為主的該方法治療青春期尋常型痤瘡不僅可有效改善患者的皮損狀態，而且降低患者外

周血中單核細胞表面TLR2的表達，同時降低血清IL4、IL8、TNFα和COX2水平。

首先，和健康人群比較，痤瘡患者TLR2水平表達顯著上調，和林玲等人的研究結果一致[15]，提示固有免疫失調是此類患者的主要特點之一，從固有免疫調節方面來治療皮膚病包括痤瘡已成為重要的研究方向之一[1621]。本研究發現經過中藥治療后患者外周血單核細胞TLR2表達顯著降低，提示調節固有免疫可能是該方法治療痤瘡的主要機制之一。其次，作為TLR2下游信號通路中的關鍵促炎性反應因子IL4、IL8、TNFα和COX2均在痤瘡患者中有較高表達，水平痤瘡丙酸桿菌引起的機體免疫失衡伴有明顯的炎性反應參與，經過中藥治療后，患者體內的炎性反應標記物下降，說明中藥改善了患者炎性反應免疫之間的平衡，在提高免疫降低炎性反應方面有重要作用。總之，苓桂劑的應用可能通過下調CD14+單核細胞TLR2表達及分泌相關炎性因子改善體內的炎性反應，從而使固有免疫“正常化”而減輕痤瘡。

本研究的局限性：1）本研究只納入了部分特定的痤瘡人群，由于不同年齡及發作時間有別，患者體質各異，此種方法可能只適用于部分痤瘡患者，應該在中醫辨證下合理應用。2）本實驗未能揭示苓桂劑激活固有免疫的具體信號通路及靶點，下一步細胞實驗更能證實苓桂劑的主要靶點及內在機制。

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（2018-02-26收稿責任編輯：張雄杰）