楤木根皮多糖硫酸酯的制備、結構表征及抗氧化活性的研究

楊洋　王一峰　馬詣欣　祁如林　楊亞軍

摘要： 該研究以產自甘肅徽縣太白鄉的楤木根皮多糖（ACP）為材料，通過氯磺酸-吡啶法（CSA-Py）合成了楤木根皮多糖硫酸酯（SACP）。通過響應面（RSM）實驗確定的最佳反應條件：CSA/Py為2.53，反應時間為5.23 h，反應溫度為61.25 ℃，DS理論最大值為0.57。通過紅外光譜分析（FT-IR）、X射線光電子能譜（XPS）對產物進行表征，SACP結構中已引入硫酸基團，S以S6+形式存在。氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS）檢測顯示，SACP由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖組成。采用體積排阻色譜-激光光散射聯用法（SEC-LLS）測得的平均分子量（Mw）顯示，酸性反應導致Mw降低。 體外抗氧化活性發現，SACP有極好的清除O-2·的能力，有較好的清除DPPH自由基、·OH自由基的能力，還原力很強，對Fe2+有較好的螯合能力，具有濃度依賴性。從構效關系來看，清除DPPH自由基、·OH自由基、O-2·自由基以及還原力的能力均與DS呈正相關。上述研究表明了ACP及SACP的化學結構以及化學修飾對ACP抗氧化活性的影響。

關鍵詞： 楤木根皮多糖， 硫酸酯化， 響應面法， 結構表征， 抗氧化活性

中圖分類號： Q945.79文獻標識碼： A文章編號： 1000-3142（2018）07-0911-13

Abstract： Aralia chinensis stem-bark polysaccharides （ACP） were from Hui County of Longnan City in Gansu Province， China. Chemical modified A. chinensis stem-bark polysaccharide （ACP） was prepared， and the structure-activity relationship was studied. By chlorosulfonic acid pyridine method （CSA/Py）， A. chinensis root-bark polysaccharide sulfation （SACP） was synthesized. The optimum reaction conditions determined by the response surface （RSM） experiments were as follows： the ratio of CSA/Py was 2.53， the reaction time was 5.23 h， and the reaction temperature was 61.25 ℃. Under such conditions， the sulfated polysaccharides with the degree of substitution （DS） of 0.57 were obtained， which was in accordance with the expectations of the model. The result of infrared spectroscopy（FT-IR） and X ray photoelectron spectroscopy （XPS） showed that sulfuric acid groups had been introduced into SACP， and S existed in the form of S6+. The average molecular weight （Mw） which was texted by size exclusion chromatography with laser light scattering method （SEC-LLS） showed that acidic reaction conditions caused the reduction of Mw. Gas chromatography mass spectrometry （GC-MS） analysis showed that monosaccharide composition of SACP were arabinose， glucose， galactose and mannose. The results of antioxidant activities of SACP and ACP in vitro showed scavenging ability on DPPH radical， hydroxyl radical， superoxide radical in a dose dependent manner， and good potential for reducing power. The free radicals scavenging ability of SACP was higher than that of ACP， which indicated that the introduction of sulfuric acid groups could enhance antioxidant ability of ACP. The above study revealed the structure of ACP and ACSP， and the effect of chemical modification on the antioxidant activity of ACP.

Key words： Aralia chinensis root-bark polysaccharides， sulfation， response surface methodology， structural characteristics， antioxidant activity

近些年對多糖活性的研究發現，多糖具有良好的抗氧化酶活性、清除自由基等生物活性，并且多糖的結構能直接或間接的影響多糖活性。對多糖進行硫酸化修飾后，多糖的抗氧化活性得到了進一步的提高（靳文娟和魯曉翔，2012；許春平等，2015）。因而多糖的硫酸酯化修飾逐漸成為現今研究熱點之一。我國地大物博，多糖的資源極其豐富，尤其是類似于中草藥的植物多糖具有很大的開發潛力。近年來我國對靈芝、香菇、川穹、茯苓等中草藥多糖進行了大量研究，并取得了巨大的進展（戴則林和董昌武，2005；呂國英和范雷法，2009；楊鐵虹等，2003）。但是，對楤木的相關研究卻較為少見。

楤木（Aralia chinensis），系五加科（Araliaceae）楤木屬植物。主要分布于甘肅、陜西、河北中部、山西、云南， 楤木以根皮和莖皮入藥，具有鎮痛消炎（肖本見等，2006）、抗腫瘤（任美萍等，2009）、抗衰老的功效（裘名宜和馮龍飛，2006），可以用來治療糖尿病、跌打損傷等。趙博等（2015）研究了中國楤木粗多糖對糖尿病大鼠的降血糖作用，ACP能夠有效降低糖尿病大鼠的空腹血糖、糖化血紅蛋白、總膽固醇、甘油三脂水平，提高高密度脂蛋白水平，有效調節糖尿病大鼠血脂代謝紊亂。本課題組前期對楤木根皮多糖（ACP）的提取進行了研究。結果顯示ACP是由Ara、Glc、Gal三種單糖組成，重均分子量為Mn=5.259×105 g·mol-1。確定了ACP的一級化學結構。雖然關于多糖硫酸化的研究較多，但與蛋白質和核酸相比還是有一定的差距。因此，對于多糖在生物體內的作用機制、多糖復雜的高級結構以及構效關系等方面的問題需要我們更加深入地研究。本研究對合成楤木根皮多糖硫酸酯的工藝優化，結構表征及其抗氧化活性進行研究，旨在為今后楤木資源的保護及合理利用提出理論依據。

1材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料：經純化后的楤木根皮多糖（產自甘肅徽縣太白鄉）常規熱水浸提的楤木根皮多糖ACP。取代度為0.71的SACPM-DS（M-DS），取代度為0.34的硫酸化后的楤木根皮多糖SACPL-DS（L-DS），取代度為1.18的硫酸化后的楤木根皮多糖SACPH-DS（H-DS）。

試劑：1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），無水乙醇，抗壞血酸Vc，H2O2，水楊酸，HCl，鄰苯三酚，Tris-HCl，硫酸亞鐵，三氯乙酸，氯化亞鐵，鐵氰化鉀，甲酰胺，吡啶（3A分子篩除水），氯磺酸（CSA），無水乙醇，氫氧化鈉（NaOH）。

儀器：燒杯，三頸燒瓶，鐵架臺，攪拌器，冷凝管，滴液漏斗，pH試紙，透析袋等。設備：Labtech UV1000紫外可見分光光度計，LGJ-18S真空冷凍干燥機，SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵，TDL5M臺式冷凍離心機，SB-35型旋轉蒸發儀（EYELA），LGJ-18S冷凍干燥機，BL320H電子分析天平，Allegra 64R高速冷凍離心機，RE-52AA旋轉蒸發儀，UV-2000紫外可見分光光度計，SHB循環水式真空泵。

1.2 方法

1.2.1 氯磺酸/吡啶法（CSA/Py）合成SACP取無水吡啶置于三口瓶中，經冰鹽浴冷卻后，用恒壓滴液漏斗緩慢滴加氯磺酸，40 min內滴完得到酯化試劑，存放備用。精密稱取純化的楤木根皮多糖（ACP）300 mg，室溫下用60 mL甲酰胺溶解5 h，待溶解后移至恒壓滴液漏斗中，緩慢加入上述酯化試劑，攪拌10 min后將按照設計好的反應條件進行反應。反應結束后，用飽和NaOH調pH至7.5后，放入透析袋中用蒸餾水透析48 h。透析袋內液體50 ℃減壓濃縮后，加入少量無水乙醇沉淀，冷凍干燥得到楤木根皮多糖硫酸酯（SACP）。

根據響應面設計原理，依據不同因素對實驗結果的影響，選取CSA/Py（A）、時間（B）和溫度（C）三個因素進行響應面分析，具體試驗設計見表1。采用Design expert 9.0 軟件進行分析。

1.2.3 總糖、糖醛酸、蛋白含量及溶解度的測定

1.2.3.1 溶解度和總糖含量的測定在恒溫保溫桶中加入適量的蒸餾水，25 ℃下加入多糖樣品，每隔30 min測定一次溶液中多糖的含量，當結果穩定時達到溶解平衡。當沒有溶解的多糖沉于底部后，抽取部分上清液，過濾，從濾液中取樣分析多糖含量（苯酚-硫酸法），計算此溫度下的溶解度。總糖含量采用苯酚-硫酸法測定。

1.2.3.2 蛋白含量測定精確配制1 000 μg·mL-1的標準牛血清蛋白液，搖勻，分別取0.02、0.04、0.06、0.08和0.1 mL于帶塞試管中，均以蒸餾水補至1.0 mL，然后各加5 mL的考馬斯亮藍G-250試劑，混勻，放置2 min后，在595 nm波長處測定各試管溶液的吸光值（張惟杰，1999）。

1.2.4 SACP的表征

1.2.4.1 紅外光譜分析（FT-IR）在瑪瑙研缽內放入干燥后的待測多糖樣品1 mg，干燥的溴化鉀粉末100～200 mg，研磨成均勻粉末進行壓片，用Thermo Nicolet iS10紅外光譜儀進行分析。

1.2.4.2 X射線光電子能譜（x-ray photoelectron spectrometry，XPS）XPS（PHI-5702，USA），激發源為Mg Kα線，能量為29.35 eV，樣品的倉壓力為2×10-9 Torr（2.67×10-7 Pa），電壓值15 kV，功率為200 W。結合能精度為0.3 eV，Multipak6.1a軟件對數據進行處理。

1.2.4.3 分子量測定多糖樣品的分子量采用體積排阻色譜（size-exclusion chromatograph，SEC）-光散射聯用進行測定。多角度激光光散射儀（multi-angle laser photometer， MALLS） λ=690 nm （DAWN EOS， Wyatt Technology Co.， USA）。色譜柱（UltrahydrogelTM column， 7.8 mm × 300 mm，Waters， USA）。示差折光檢測器（Optilabrefractometer） （Dawn， Wyatt Technology Co.， USA）（宋坤，2014）。

1.2.4.4 單糖組成10 mg SACP加入4 mL 4 mol·L-1的三氟乙酸，120 ℃油浴水解8 h（N2作保護），60 ℃條件下進行減壓濃縮后，加入10 mg鹽酸羥胺和0.5 mL吡啶，在油浴條件下反應30 min （90 ℃），加入0.5 mL的乙酸酐，乙酰化反應30 min （90 ℃），進行減壓濃縮（60 ℃）。氯仿萃取后的衍生物用0.22 μm有機濾膜過濾，取 0.2 μL樣品，GC-MS分析。

GC條件：進樣口溫度設置為250 ℃，柱箱起始溫度設置為160 ℃，保留3 min，然后以2 ℃·min-1的速度升至210 ℃，保持1 min，載氣是氦氣，流速設置為1.0 mL·min-1。

標準單糖為鼠李糖（Rha）、來蘇糖（Lyx）、阿拉伯糖（Ara）、木糖（Xyl）、甘露糖（Man）、葡萄糖（Glu）和半乳糖（Gal）。標品單糖做同上處理（宋坤，2014）。

1.2.5 抗氧化活性測定

1.2.5.1 對DPPH自由基的清除作用 分別取2 mL濃度0.02、0.05、0.1、0.5、1、2、5 mg·mL-1的SACP溶液及Vc溶液與0.5 mL的DPPH（2×10-4 mol·L-1）搖勻， 30 min后測各樣品吸光值Ai。分別取DPPH溶液與70%的乙醇2 mL置于待測試管充分混合測得其吸光值A0。分別取2 mL待測液與70%的乙醇振蕩搖勻測吸光值Aj，70%乙醇做空白。ACP的DPPH自由基清除能力測量方法同上。以Vc為對照品（Wang et al，2009）。依據式（2）來計算ACP、SACPHDS、SACPMDS、SACPLDS對DPPH自由基的清除率。

清除率=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%（2）

1.2.5.2 對超氧陰離子自由基（O-2·）的清除作用待測試管內分別加入4.5 mL的pH8.20的Tris-HCl緩沖液（50 mmol·L-1）、4.2 mL蒸餾水和5 mmol·L-1鄰苯三酚溶液 0.3 mL充分混合，在325 nm處測5次吸光值，30 s為一次，計算其吸光值與反映時間的變化率（△A0）。分別取濃度0.02、0.05、0.1、0.5、1、2、5 mg·mL-1的多糖溶液及Vc溶液2 mL加入3.2 mL蒸餾水混勻，在325 nm 處測定含樣品的鄰苯三酚溶液的吸光值，計算其吸光值隨時間的變化率（△A）。蒸餾水作空白。每個樣品重復3次，以濃度對清除率的平均值作圖（Wang et al，2010）。依據式（3）計算樣品對O-2·的清除率。

清除率=[（△A0-△A）/△A0]×100%（3）

1.2.5.3 對Fe2+的螯合能力分別量取濃度0.02、0.05、0.1、0.5、1、2、5 mg·mL-1的SACP溶液及EDTA-2Na溶液1 mL，以及0.05 mL的FeCl2（2 mmol·L-1）充分混合，加入0.2 mL的5 mmol·L-1菲洛嗪（ferrozine）混勻， 10 min后，用蒸餾水調零，在562 nm處測吸光值A1。同樣操作以水代替多糖溶液為對照實驗測定吸光值A0，同樣操作以水代替FeCl2溶液為樣品干擾實驗測吸光值A2，作空白實驗調零用（Wang et al，2010）。以式（4）計算對Fe2+螯合能力。

螯合率=[A0-（A1-A2）]/A0×100%（4）

1.2.5.4 對羥自由基（·OH）的清除作用在待測試管中分別加入2 mL濃度0.02、0.05、0.1、0.5、1、2、5 mg·mL-1的多糖溶液、Vc溶液、水楊酸-乙醇溶液（9 mmol·L-1）、 FeSO4溶液（9 mmol·L-1）及H2O2（6 mmol·L-1），充分混合，水浴鍋加熱30 min溫度設定為37 ℃，510 nm處測得其吸光值A1。不加H2O2時的溶液吸光值為A2。不加樣時的溶液測得吸光值A0。蒸餾水作為參比。測量ACP 清除羥自由基·OH的方法同上。用 Vc 作為實驗對照。重復3次，取濃度對清除率的平均值作圖（Zhao et al，2013）。用式（5）計算 SACPHDS、SACPMDS、SACPLDS對羥自由基·OH 的清除率。

清除率=[A0-（A1-A2）]/A0×100%（5）

1.2.5.5 還原力在試管中加入 1 mL濃度0.02、0.05、0.1、0.5、1、2、5 mg·mL-1的多糖溶液、Vc溶液，2.5 mL的0.2 mol·L-1，pH6.6的磷酸鹽緩沖液（PBS）和K3Fe（CN）6溶液（1%），置于50 ℃恒溫水浴中反應20 min，立即冷卻，加入2.5 mL TCA （10%），充分混合，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液2.5 mL加入2.5 mL蒸餾水， FeCl3溶液1 mL（0.1%），搖勻后，蒸餾水調零，700 nm處測定吸光值，每個濃度重復實驗3次。還原能力和吸光值呈正相關關系（Qi et al，2006）。

2結果與分析

2.1 響應面結果

參數的最佳化分析采用Design Expert軟件進行，結果見表2。對數學模型方程求一階偏導數為零，求出極點值轉換為酯化反應，得到最佳測定條件：CSA/Py為2.53，反應時間為5.23 h，反應溫度為61.25 ℃，DS理論最大值為0.57。

以DS為響應值，對實驗結果進行回歸擬合后建立數學模型為Y=0.85-0.035A+0.069B+3.75E-0.03AB-0.015AC+0.017BC-0.055A2-0.087B2-0.077C2（6）

這說明方程的擬合程度較好，通過方程可以很好地預測試驗結果。模型的Prob>F，失擬項不顯著，表明在回歸方程中沒有失擬的因素存在，回歸式擬合較好，模型可信度高，可以通過該模型優化制備SACP的工藝條件。

利用Design Expert軟件對CSA/Py、反應時間、反應溫度三個因素進行響應面實驗設計，結果見表3。

2.1.1 因素間交互作用從圖1：A和圖1：B可以看出，隨著酯化時間增加，SACP的DS逐漸升高，但酯化時間過長，會引起多糖的部分降解。隨著反應溫度的升高，DS呈先上升后下降的趨勢，由此發現溫度太低影響酯化反應的進行，同時溫度太高多糖又會在高溫下降解。

從圖1：C和圖1：D可以看出，隨著時間的增加，DS明顯升高，但在高酸性條件下，酯化時間過長會引起多糖部分降解；CSA/Py的體積比小，CSA含量少，SACP的取代度較低；CSA的含量太高，高酸性條件會使得部分多糖降解，降低硫酸化的效果。

從圖1：E和圖1：F可以看出，溫度過高以及酸性太強都不利于酯化反應的進行。

根據實際操作的方便情況，選擇CSA/Py=2.5∶1，反應溫度61 ℃，反應時間5 h進行重復試驗，具有較好的重復性，當楤木根皮多糖鏈中伯羥基上的氫被硫酸基團取代時，此條件下硫酸根取代度為0.56，證明了響應面優化法優化SACP的可行性。

2.2 SACP的理化性質

ACP能溶于水，易溶于熱水，不溶于乙醇、乙醚、丙酮、氯仿和正丁醇。SACP能溶于水，易溶于熱水，不溶于乙醇、乙醚、丙酮、氯仿和正丁醇。從表4可以看出，SACP總糖含量，蛋白含量均有所下降，這是由于多糖發生降解導致的。對多糖進行改性目的之一，是為了提高多糖的溶解性。從表4看出，SACP的溶解性比ACP強很多。這是由于硫酸基團的引入，使多糖溶解性增強。

2.3 SACP的表征

2.3.1 FT-IR從圖2可以看出，硫酸化前后多糖母體特征吸收未發生變化。新的吸收峰出現在1 242.11 cm-1和808.14 cm-1處，分別為S=O不對稱伸縮振動，及C-O-S的伸縮振動（劉琴等，2014）。這說明硫酸酯化反應已經發生了，且隨著DS升高， 1 242.11 cm-1和808.14 cm-1處的吸收峰隨之增高。

800～850 cm-1之間的區域可用來推測出硫酸基的取代位置。845 cm-1、830 cm-1和810 cm-1分別對應3位、2位和6位取代（Maciel et al，2008）。由此可知， SACP的C-6位發生了取代。這可能是因為SACP結構復雜，空間位阻使得C-2、C-3的羥基很難發生反應。

2.3.2 XPSXPS為一種物質表面組成及結合狀態的表征手段。從圖3：A可以看出，SACP中出現了S 2p峰，這說明S已經引入到SACP中，而樣品ACP中無S 2p峰的存在。從表5可以看出ACP和SACP的表面元素組成，發現SACP中出現了含量不同的S元素。由此可以確定SACP中有S的存在。從XPS測定的表面元素組成來看，SACP樣品中的S含量各不相同，這與我們之前測的元素分析結果有偏差，是因為XPS測定的只能是SACP表面元素的相對含量，僅用于半定量，無法準確定量， 且XPS的取樣深度小于100。因此， 對于結構復雜的分子內部，無法掃描。XPS主要為了表征S的價態，會和體相分析出的硫含量不同（王建祺，1992）。

從圖3：B可看出，C存在至少兩種以上的能態。圖 1溫度、時間及比例與取代度之間的交互作用我們根據譜峰的形狀特征對其進行曲線擬合得到圖4。結合能在284.5 eV處為C-H，在286.1 eV處為C-OH。硫酸化后C 1s結合態的比例發生了較大變化，286.1 eV的峰減弱了，說明部分-OH發生取代。根據表面元素組成結果得到ACP的C/O為1.61，SACP的C/O為1.27。這說明-SO3-的引入使O的比例增加，導致SACP中C/O降低。圖3：C為ACP和SACP的O 1s譜，反應前ACP的O 1s在535.5 eV處，反應后O 1s移動了約0.2 eV，反應前后出現位移情況說明取代基對O產生了影響。圖3：D為ACP和SACP的S 2p譜，在ACP中沒有S 2p， 在SACP中出現了明顯的S 2p信號峰，結合能為170.6 eV，S 2p的結合能在170 eV左右說明S為S6+，由此可以得到SACP中的S以-SO3-的形式存在。在制備酯化試劑的過程中，CSA的S為S6+，不存在其他氧化還原反應，由此所得SACP圖 2CSA/Py 合成的SACP的紅外圖譜中的S為S6+。

2.3.3 分子量SACP的SEC-LLS色譜圖如圖5所示，圖5顯示為單一對稱峰值，表明SACP的均勻性，與ACP相比SACP的出峰時間晚于ACP。根據體積排阻色譜原理，分子量越小出峰時間越晚。ACP的分子量：重均分子量Mw=1.308×106 g·mol-1，數均分子量Mn=4.373×105 g·mol-1，分子量分布指數Mw/Mn=2.991。SACP的分子量：重均分子量Mw=1.96×105 g·mol-1，數均分子量Mn=6.06×104 g·mol-1，分子量分布指數Mw/Mn=3.234。通過數據可以得到，硫酸化后多糖分子量比硫酸化前小很多。這可能是在制備SACP的過程中，強酸對分子鏈發生了降解， 導致分子量變小（Yang et al，2005）。多糖的降解可能是由于多糖在酸性條件下不穩定發生了水解反應，所以在多糖硫酸化的反應中去除殘留水是至關重要的一個步驟（Zou et al，2008）。

2.3.4 單糖組成從圖6和表6可以看出，ACP和SACP中4個峰的保留時間與單糖標品中Ara、Man、Glc、Gal的色譜峰相吻合， 說明SACP的組成圖 5ACP和SACP的SEC-LLS檢測結果圖與未反應前基本一致。從Ara、Man、Glc、 Gal幾種單糖組成可以看出，酯化反應僅對取代基產生了影響，但是組成SACP單糖的摩爾比卻發生了較大變化。Ara由反應前的11.58變為2.65，Man由反應前的4.85變為4.24，Glc由反應前的53.08變為42.87，Gal由反應前的16.87變為10.08。這說明在進行酯化反應時，酯化試劑對多糖鏈進行了降解。由于Ara、Glc、Gal比例的明顯降低，可推測出ACP的分子鏈在酯化反應中降解的很厲害，導致了Ara、Glc、Gal單糖片段在整個反應中的大量損失。

2.4 抗氧化活性測定

2.4.1 對DPPH自由基的清除作用以Vc作為陽性對照。樣品ACP和SACP都具有良好的清除DPPH自由基作用，測定結果如圖7所示。在整個有效濃度范圍內，隨著樣品濃度的增加，對DPPH的清除能力都呈現增長趨勢，具有濃度依賴性。高DS的多糖硫酸酯顯示出較強的清除DPPH自由基能力，其半抑制濃度IC50為 1.219 mg·mL-1。中等DS和低DS的清除DPPH自由基能力較弱，其半抑制濃度IC50分別為3.268 mg·mL-1和2.364 mg·mL-1。SACP對DPPH的清除能力都遠高于ACP（IC50=3.902 mg·mL-1），濃度為1 mg·mL-1 時，差異增大。這說明硫酸化修飾可以顯著增強SACP對DPPH自由基清除活性，DS越高清除能力越強。多糖抗氧化活性的作用主要是由于其苯酚結構的供氫質子的能力，可使有 高度氧化性的自由基還原（Wang et al ，2014）。本研究中，H-DS具有最強的清除DPPH自由基的能力， 可能是由圖 6GC-MS色譜圖于DS高的樣品具有更強的活化異頭碳氫原子的能力，其氫原子分解能力較強。

2.4.2 對超氧陰離子自由基（O-2·）的清除作用ACP和SACP對超氧自由基的清除作用效果如圖8所示。SACP和ACP均具有清除O-2·能力，但不同濃度的樣品對超氧自由基的清除能力是不同的，隨著濃度增加清除O-2·效果逐漸增強。由圖8可知，在0.1 mg·mL-1時H-DS、M-DS、L-DS和ACP對O-2·的清除率分別為76.59%、70.32%、72.43%、34.29%，而在5 mg·mL-1時H-DS、M-DS、L-DS和ACP對O-2·的清除率分別為92.76%、88.56%、84.45%、80.33%。由此可以得到在有效濃度范圍內，清除率與濃度呈正相關。在0.02～0.5 mg·mL-1范圍內，改性后樣品清除O-2·的能力要強于Vc和ACP，所有改性后的樣品清除O-2·的效果優于未改性前，隨著硫酸基含量升高多糖對O-2·的清除作用越強。Wang et al（2008）的研究表明DS較高的樣品顯示出更強的清除超氧自由基的作用，與本研究結果一致。因此，從DS角度分析，清除O-2·能力與DS呈正相關，DS越高，清除O-2·能力越強。

2.4.3 對Fe2+的螯合能力從圖9可以看出，ACP、H-DS、M-DS、L-DS都具有一定的金屬螯合能力，且隨著濃度不斷增大，對金屬的螯合能力不斷增強，所有樣品Fe2+的螯合能力與濃度呈依賴的關系。從圖9看出硫酸化前后多糖對Fe2+螯合能力都不是很強，并沒有明顯的DS依賴關系。姚磊等（2012）對豆渣纖維多糖進行了改性，之后測定其對亞鐵離子的螯合能力，發現其樣品的亞鐵離子螯合能力和濃度呈劑量性依賴，和本實驗結果一致。

2.4.4 對羥自由基（·OH）的清除作用 由圖10可知，ACP和SACP對·OH自由基都具有較好的清除作用。在0.01～0.1 mg·mL-1范圍內，僅H-DS對·OH 的清除略高于ACP，而M-DS和L-DS 對·OH 的清除作用與ACP差別很小。濃度大于0.1 mg·mL-1時，硫酸基含量和多糖清除·OH 自由基的能力呈正相關。濃度為5 mg·mL-1時，H-DS、M-DS、L-DS和ACP對OH·的清除率分別為43.33%、39.31%、35.51%、30.13%。SACP、ACP 對·OH 的清除能力均低于同濃度的Vc。說明這些樣品中H-DS對·OH的清除能力最好，可能與樣品的分子量有關。Zou et al （2008）發現，分子量最低的樣品（1.27 × 104）具有最好的清除·OH的能力。說明樣品清除·OH自由基能力與DS、濃度呈正相關，DS越高濃度越大，清除·OH自由基能力越強。由此可以推斷出硫酸基和樣品的分子量對·OH 的清除起到重要作用。這與Qi et al（2005）的研究結果一致，其機理可能是由于高取代度樣品分子中一部分的-OH被-OSO3H取代了，從而提高了·OH清除能力。

2.4.5 還原力還原能力是潛在抗氧化活性的一個重要指標。由圖11可知，在所選濃度范圍內，ACP及不同DS的SACP都具有還原能力，總還原能力和濃度呈正相關關系，SACP的總還原力大于ACP，且這種趨勢在取代度增大的情況下越加明顯。Wang et al（2008）制備了海帶多糖硫酸酯，并測定其還原力，發現改性后的海帶多糖的還原力明顯提高，與本研究結果一致。這說明硫酸基的引入能提高SACP的還原力，可能是由于SACP較強的供氫能力。多糖的分子量是影響其抗氧化活性的一個重要參數，本研究結果顯示，DS較高而分子量較低的多糖樣品的還原力較好。因此，多糖抗氧化能力的強弱不是由單個因素決定的，而是多種因素共同作用的結果。

3結論

本研究采用氯磺酸-吡啶法（CSA-Py）合成了楤木根皮多糖硫酸酯（SACP），通過響應面（RSM）實驗確定了最佳反應條件：CSA/Py為2.53，反應時間為5.23 h，反應溫度為61.25 ℃。采用紅外光譜（FT-IR）、X射線光電子能譜（XPS）、體積排阻色譜-激光光散射聯用法（SEC-LLS）、氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS）對SACP進行結構表征。結果發現，通過紅外光譜分析得知（FT-IR），新的吸收峰出現在1 242 cm-1和808 cm-1處。通過X射線光電子能譜（XPS）從全譜中可以很明顯的看出，SACP中出現了S 2p峰，S 2p的結合能在170.6 eV左右說明S為S6+。因此可以得到，SACP中的S以-SO3-的形式存在。采用體積排阻色譜-激光光散射聯用法（SEC-LLS）測得的平均分子量（Mw）顯示，酸性反應導致Mw降低。氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS）檢測顯示SACP由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成。通過實驗檢測修飾前后產物抗氧化活性的變化，發現SACP有極好的清除O-2·的能力，有較好的清除DPPH自由基、·OH自由基的能力，還原力也很強，對Fe2+也有較好的螯合能力，具有濃度依賴性。這說明經硫酸化修飾后，引入的硫酸根基團使得多糖活性得到提高。這為今后楤木根皮多糖（ACP）的利用和藥理機制提供了進一步的參考價值。

參考文獻：

DAI ZL，DONG CW， 2005. Advances on the research of Ganoderma lucidum polysaccharides biological activities [J]. J Anhui Univ Chin Med， 24（5）：60-62. [戴則林， 董昌武， 2005. 靈芝多糖的生物活性研究進展 [J]. 安徽中醫藥大學學報， 24（5）：60-62.]

JIN WJ， LU XX， 2012. Antioxidant activity of sulfating Cantharellus cibarius polysaccharide in vitro [J]. Food Sci Technol， （10）：177-181. [靳文娟， 魯曉翔， 2012. 硫酸化雞油菌多糖的體外抗氧化作用研究 [J]. 食品科技， （10）：177-181.]

L GY， FAN LF， 2009. Development of research on lentinan [J]. Acta Agric Zhejiang， 21（2）：183-188. [呂國英， 范雷法， 2009. 香菇多糖研究進展 [J]. 浙江農業學報， 21（2）：183-188.]

LIU Q， SONG K， YIN ZX， et al， 2014. Study on preparation， chemical structure and antioxidant activity of polysaccharide sulfate from watermelon [J]. Sci Technol Food Ind， 35（14）：107-113. [劉琴， 宋珅， 殷振雄， 等， 2014. 籽瓜多糖硫酸酯的制備工藝、化學結構及其抗氧化活性研究 [J]. 食品工業科技， 35（14）：107-113.]

MACIEL JS， CHAVES LS， BWS S， et al， 2008. Structural characterization of cold extracted fraction of soluble sulfated polysaccharide from red seaweed Gracilaria birdiae [J]. Carbohyd Poly， 71（4）：559-565.

QI H， ZHANG Q， ZHAO T， et al， 2005. Antioxidant activity of different sulfate content derivatives of polysaccharide extracted from Ulva pertusa （Chlorophyta） in vitro [J]. Intern J Biol Macromol， 37（4）：195-199.

QI H， ZHANG Q， ZHAO T， et al， 2006. In vitro antioxidant activity of acetylated and benzoylated derivatives of polysaccharide extracted from Ulva pertusa （Chlorophyta） [J]. Bioorg Med Chem Lett， 16（9）：2441-2445.

QIU MY， FENG LF， 2006. Reserch on the anti-aging effect of saponin of Aralia deceisneana Hance [J]. Lishizhen Med Mat Med Res， 17（2）：2480-2481. [裘名宜， 馮龍飛， 2006. 黃毛楤木皂苷的抗衰老作用研究 [J]. 時珍國醫藥， 17（12）：2480-2481.]

REN MP， LIU MH， CHEN Y， et al， 2009. Research on antitumor activity of Aralia saponins [J]. Lishizhen Med Mat Med Res， 20（1）：2480-2481. [任美萍， 劉明華， 陳怡， 等， 2009. 楤木皂苷抗腫瘤活性研究 [J]. 時珍國醫國藥， 20（1）：2417-2418.]

SONG K， 2014. Study on extraction， purification， monosaccharide composition， sulfation and hypoglycemic effect of Sphallerocarpus gracilis polysaccharide [D]. Lanzhou：Northwest Normal University：54-59. [宋珅， 2014. 黃參多糖的提取、分離純化、單糖組成、硫酸化修飾和降血糖作用研究 [D]. 蘭州：西北師范大學：54-59.]

WANG J， NIU S， ZHAO B， et al， 2014. Catalytic synthesis of sulfated polysaccharides Ⅱ： Comparative studies of solution conformation and antioxidant activities [J]. Carbohydrate Polymers， 107（1）：221-231.

WANG JL， ZHANG J， WANG XF， et al， 2009. A comparison study on microwave-assisted extraction of Artemisia sphaerocephala polysaccharides with conventional method：Molecule structure and antioxidant activities evaluation [J]. Intern J Biol Macromol， 45（5）： 483-492.

WANG JL， ZHANG J， ZHAO BT， et al， 2010. A comparison study on microwave-assisted extraction of Potentilla anserina polysaccharides with conventional method： Molecule structure and antioxidant activities evaluation [J]. Carbohyd Poly， 80（1）：84-93.

WANG J， ZHANG QB， ZHANG ZS， et al， 2008. Antioxidant activity of sulfated polysaccharide fractions extracted from Laminaria japonica [J]. Intern J Biol Macromol， 42（2）：127-132.

WANG JQ， 1992. Electronspectroscopy（XPS/XAES/UPS）introduction [M]. Beijing： National Defence Industry Press：38-98. [王建祺， 1992. 電子能譜學（XPS/XAES/UPS）引論 [M]. 北京：國防工業出版社：38-98.]

XIAO BJ， TAN ZX， LIANG WM， 2006. Studies on anti-inflammatory and immune effect of root bark of Aralia echinocaulis [J]. Chin J Mod Appl Pharm， 23（6）：438-440. [肖本見， 譚志鑫， 粱文梅， 2006. 刺莖楤木根皮抗炎和免疫作用的研究 [J]. 中國現代應用藥學雜志， 23（6）：438-440.]

XU CP， ZHAO SS， YANG CC， et al， 2015. Sulfation and antioxidative activity of polysaccharide from flue-cured tobacco leaves [J]. Tobacco Sci Technol， 48（7）：41-45. [許春平， 趙珊珊， 楊琛琛， 等， 2015. 烤煙多糖的硫酸化修飾及抗氧化活性 [J]. 煙草科技， 48（7）：41-45.]

YANG J， DU Y， HUANG R， et al， 2005. The structure-anticoagulant activity relationships of sulfated lacquer polysaccharide：Effect of carboxyl group and position of sulfation [J]. Intern J Biol Macromol， 36（1-2）：9.

YAO L， WANG ZY， ZHAO HT， et al， 2012. Antioxidant activities of polysaccharides from soil bean meal [J]. J NE Agric Univ， 43（11）：16-19. [姚磊， 王振宇， 趙海田， 等， 2012. 豆渣纖維改性多糖的抗氧化活性研究 [J]. 東北農業大學學報， 43（11）：16-19.]

YANG TH， JIA M， MEI QB， 2003. Immunoloregulation effect of angelica polysaccharide isolated from Angelica sinensis [J]. Chin Pharma Bull， 19（4）：448-450. [楊鐵虹， 賈敏， 梅其炳， 2003. 當歸多糖對小鼠免疫功能的影響 [J]. 中國藥理學通報， 19（4）：448-450.]

ZHAO B， WANG YF， HOU HH， 2015. Hypoglycemic effect of crude polysaccharide extract from Aralia chinensis on diabetic rice [J]. Food Sci， 36（13）：211-214. [趙博， 王一峰， 侯宏紅， 2015. 中國楤木粗多糖對糖尿病大鼠的降血糖作用 [J]. 食品科學， 36（13）：211-214.]

ZHAO BT， ZHANG J， GUO X， et al， 2013. Microwave-assisted extraction， chemical characterization of polysaccharides from Lilium davidii var. unicolor Salisb and its antioxidant activities evaluation [J]. Food Hydrocolloid， 31（2）：346-356.

ZOU C， DU Y， LI Y， et al， 2008. Preparation of lacquer polysaccharide sulfates and their antioxidant activity in vitro [J]. Carbohyd Poly， 73（2）：322-331.

ZHANG WJ， 1999. Saccharide complex biochemical research technology [M]. Hangzhou： Zhejiang University Press：7-126. [張惟杰， 1999. 糖復合物生化研究技術 [M]. 浙江：浙江大學出版社：7-126.]