運用BioID技術篩選水稻GS3互作蛋白

杜榮裕 周澤嬌 馮嘉琳 劉賽 陽輝勇 李洪清

摘 要：水稻異源三聚體G蛋白系統中的非典型γ亞基GS3，是一個控制籽粒大小的主效數量效應基因座，在調節籽粒大小中發揮負調控因子的功能。BioID （proximitydependent biotin identification） 為鄰近蛋白標記技術，其工作原理是生物素連接酶能使其周圍的蛋白帶上生物素，同時生物素又能和鏈霉親和素緊密結合，所以能夠利用鏈霉親和素偶聯的磁珠富集目標蛋白。該技術具有靈敏、高效和周期短等特點，為篩選互作蛋白提供了新方法。為了解析GS3的蛋白調控網絡，該研究以水稻原生質體為材料，采用BioID 技術對GS3在水稻中的互作蛋白進行了篩選。Westernblot結果表明：融合蛋白BirAGGS3在原生質體中成功表達并生物素化GS3鄰近蛋白。使用鏈霉親和素磁珠富集生物素化后的蛋白，并進行蛋白質譜測序，獲得了與GS3鄰近的可能存在直接或間接互作的蛋白。將獲得的蛋白進行功能富集與注釋，并構建蛋白-蛋白互作網絡。對部分蛋白進行了BiFC 驗證，發現GS3可能與ICL、PPDK、RPN7和RH15發生相互作用，涉及能量代謝的調節、種子淀粉物質的儲存、泛素-蛋白酶體系統以及凋亡途徑等生物過程。

關鍵詞：BioID，GS3，水稻，籽粒大小，互作蛋白

中圖分類號：Q943

文獻標識碼：A

文章編號：10003142（2018）06077110

Abstract：GS3，encoding the noncanonical γ subunit of heterotrimeric G proteins system in rice，is a major quantitative trait locus for grain size in different rice varieties，serving as a negative regulator in seed or organ size. Newlydeveloped BioID （proximitydependent biotin identification） system，which detects proximal proteins in vivo，has been successfully applied in different species for its features of sensitivity，high efficiency and fast speed. And the mechanism of BioID is that the biotin ligase，the core component，could attach biotin to the proximal proteins，and the biotin also connects tightly with streptavidin，therefore，the beads coupled streptavidin could be utilized for enriching the target proteins. In this study，we screened proteins interact directly or indirectly with GS3 in rice protoplasts by BioID method. The results of Westernblot showed that fused protein BirAGGS3 expressed and biotinylated the proximal proteins of GS3 in the protoplasts successfully. Biotinylated proteins were enriched by beads coupled streptavidin and the Mass Spectrometry sequencing performed on it. Then，the function of proteins has been annotated and enriched，meanwhile，proteinprotein interaction graph was established. Some of the candidate proteins were confirmed by BiFC，indicating the possible interaction between ICL，PPDK，RPN7 and RH15，and the engagement of GS3 in regulation of energy metabolism，stock of starch，ubiquitinproteasome system and apoptotic pathway . The above results will facilitate the elucidation of the regulation network of the function of GS3.

Key words：BioID，GS3，rice，grain size，interaction proteins

在動植物中，異源三聚體G蛋白由α、β和γ三個亞基組成，是非常重要的信號調節因子。在植物中，異源三聚體G蛋白的信號通路在生長發育與抗逆生理中起著不可替代的作用（Stateczny et al，2016）。相比哺乳動物異源三聚體G蛋白信號網絡，植物異源三聚體G蛋白家族成員的數量、結構，以及其上游受體，下游效應蛋白的成員組成，乃至整個G蛋白的循環機制都表現出非典型性（Trusov & Botella，2016）。在植物中還沒有統一的異源三聚體G蛋白網絡模型，如在擬南芥中發現了一個類似哺乳動物的7次跨膜受體類似蛋白AtRGS，但在水稻中沒有找到7次跨膜同源受體蛋白。令人意外的是，水稻中發現了一個11次跨膜受體COLD1，與異源三聚體G一起調節Ca2+通道，抵御嚴寒（Stateczny et al，2016）。最新觀點認為受體類激酶在G蛋白信號網絡中起首要作用（Choudhury & Pandey，2016）。

異源三聚體G蛋白中的非典型γ亞基GS3在水稻谷粒大小調節中起著重要作用，在水稻增產方面展現巨大的潛力。非典型的γ亞基由N端一個保守的γ類結構域、預測的跨膜域和C端半胱氨酸富集結構域組成（Botella，2012）。GS3的γ類結構域負調節谷粒大小，而其C端的尾部又反過來抑制N端的功能。這導致GS3蛋白的頭尾出現了功能上的“博弈”。GS3頭部功能越強，對谷粒長度抑制越明顯。當GS3的γ類結構域突變或者缺失，不能與β亞基形成二聚體發揮作用，谷粒最長；完整的GS3蛋白尾部抑制γ類結構域的負調控功能，減弱基因效應，粒長中等；當只有γ類結構域，基因所起的抑制效應最強，粒長最短（Mao et al，2010）。

BioID（proximitydependent biotin identification）為鄰近蛋白標記技術，該方法可以將物理空間上靠近誘餌蛋白附近的蛋白標記上生物素，用以作為蛋白質互作的證據。該技術的核心功能組件是生物素連接酶。在大腸桿菌中，生物素連接酶BirA識別的底物具有特異性，其作用的蛋白包含一段特定的氨基酸序列，并將其生物素化。如果將BirA的118位進行突變（R118G，BirA*），會極大降低其識別底物的特異性，其作用的蛋白不需要帶有特定的氨基酸也能被生物素化（Kwon & Beckett，2000）。BioID最早應用于哺乳動物細胞中（Roux et al，2012）。除了應用于動物細胞中，BioID技術也可用于單細胞生物中，如布氏錐充（Trypanosoma brucei）、剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）、盤基網柄菌（Dictyostelium discoideum）。此外，BioID技術還可用于宿主-病原體系統的研究中，如HIV1互作蛋白的研究（Varnaite & Macneill，2016）。本實驗室以水稻原生質體為材料，通過研究影響BioID在植物中應用的多種因素，建立了適合在水稻中使用BioID系統 （Lin et al，2017）。

BioID技術的操作主要包括以下流程：（1）構建帶有融合蛋白BirAG的目的蛋白表達載體，并轉化植物原生質體，瞬時表達融合BirAG的目的蛋白。（2）在有生物素的條件下進行孵育，使目的蛋白鄰近的其他蛋白被生物素化。（3）提取原生質體總蛋白與鏈霉親和素磁珠進行共孵育，被生物素化的蛋白即可吸附在磁珠上。（4）通過清洗、洗脫等步驟獲得富集的生物素化蛋白，利用westernblot 以及質譜分析的方法，可以對被生物素化的蛋白進行鑒定（Lin et al，2017）。Varnaite & Macneill（2016）研究認為，在誘餌蛋白附近10 nm范圍內的蛋白，包括直接、間接相互作用的都會被生物素化而被鑒定出來。

GS3調控種子大小的功能已經非常明確，但是關于GS3調控機制的研究比較少見。本研究采用BioID方法，一種不同于現有的酵母雙雜交的方式，篩選GS3互作蛋白，為GS3相關調控網絡的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻“中花11”（Oryza sativa）由本實驗室保存。KOD FX聚合酶購自東洋紡（上海）生物科技有限公司。限制性內切酶和T4 DNA連接酶購自大連TaKaRa生物有限公司。質粒抽提試劑盒為Axygen公司產品。大腸桿菌感受態菌株JM109為本實驗室保存。BioID載體由本實驗室保存（Lin et al，2017）。引物合成由上海生工生物技術有限公司完成。所用鏈霉親和素磁珠由Solulink公司提供。抗BirA兔源多抗為LifeSpan BioSciences公司生產。二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體，由Proteintech公司生產。RIPA強蛋白提取液、辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素為碧云天公司生產。測序由北京睿博興科生物技術有限公司完成。蛋白質譜測序由深圳市微納菲生物技術有限公司進行。

1.2 方法

1.2.1 構建水稻GS3 BioID載體 提取水稻RNA并反轉錄成cDNA，運用PCR技術對GS3 CDS進行擴增。所用引物為GS-F：GAAGATCTATGGCAATGGCGGCGGCGCCCCGGCC；GS-R：GGACTAGTTCACAAGCAGGGGGGGCAGCAACGAGGGAC。下劃線標記的序列為引入的BglⅡ和SpeⅠ的酶切位點。退火溫度為60 ℃，延伸1 min，35個循環，回收PCR產物，進行酶切與純化。

BioID的載體如圖1所示，用BamHⅠ和SpeⅠ 進行雙酶切，變性，并與獲得的GS3純化進行連接，轉化大腸桿菌，提取陽性菌株質粒，測序。

1.2.2 水稻原生質體的轉化 原生質體的轉化參照Yang et al（2014）的方法，首先將pUbi∷BirAG∷GS3轉化進400 μL水稻原生質體中（原生質體濃度約為2×106 個·L1），然后轉入pUbi∷BirAG作為陽性對照，最后在培養液中加入外源生物素（終濃度為50 μmol·L1）培養24 h。同理，再轉化一組pUbi∷BirAG∷GS3，以不加入生物素一組為陰性對照。

1.2.3 蛋白質的提取與鑒定 （1）原生質體培養24 h后，用3 000 r·min1，3 min收集原生質體；用0.6 mol·L1甘露醇洗滌原生質體，再次收集原生質體；加入700 mL RIPA強蛋白提取液，劇烈震蕩，13 000 r·min1在4 ℃下離心20 min，取上清，于-20 ℃儲存備用。（2）取15 μL的蛋白樣品在12%SDSPAGE上分離后，用濕法轉膜法將分離的蛋白轉至PVDF膜上。 電轉完畢后，使用抗BirA兔源多抗做一抗，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔抗體作為二抗，進行 Westernblot進行分析，觀察BirAG蛋白表達結果。同理，用辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素作為抗體，檢測標記上生物素的蛋白。

1.2.4 生物素化蛋白質的富集 （1）磁珠處理：渦旋震蕩原始磁珠瓶1 min，利于成團的磁珠分散；取20 μL磁珠于EP管中；磁力架上放置2 min，去上清；加入RIPA強1 mL，震蕩分散磁珠，室溫搖擺5 min；重復以上清洗步驟2次；磁珠與蛋白樣品孵育4 ℃過夜；2% SDS 清洗1次，RIPA清洗2次磁珠，將磁珠樣品懸浮在PBS緩沖液，送往公司進行蛋白質譜測序。（2）蛋白質譜測序：參照Wisniewski et al（2009）的方法，采用胰蛋白酶處理富集生物素化蛋白的磁珠，將其制成多肽溶液進行LCMS/MS分析（質譜儀型號為Triple TOF 5600 LCMS（AB SCIEX））。采用Maxquant軟件進行數據加工處理和檢索分析，數據庫為Uniprot下物種為Oryza sativa subsp. japonica蛋白數據庫。檢索參數設置如下：半胱氨酸烷基化為碘乙酰胺、可變修飾為甲硫氨酸氧化和蛋白N端乙酰化、胰蛋白酶酶解，二級質譜匹配容差為0.004%，多肽假陽性率控制為1% FDR，蛋白假陽性率控制為1%。

1.2.5 BiFC驗證互作蛋白 挑選相關的功能基因進行克隆，構建BiFC載體。進行原生質體轉化，12 h后于LSM 800激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光。所用載體為pSAT6cEYFPC1B（3108）和pSAT6nEYFPC1（E2884）。所用到的引物如下（下劃線標出酶切位點，并標注對應的內切酶）：ICLF GAAGATCTATGTCGTCGCCGTTCTCCGTGCCATCT（Bgl Ⅱ）； ICLR CGGAATTCCATCCTGGATTTGGCAAGAACATGGCT（EcoR Ⅰ）；PPDK1F GAAGATCTATGCCGTCGGTTTCGAGGGCCGTGTGC（Bgl Ⅱ）；PPDK1R GCTCTAGAGAGGAGCACCTGAGCTGCAGCTAGCCT（Xba Ⅰ）；RPN7F GAAGATCTATGGACGGCGGCGTAGGCGAGGAAGGG（Bgl Ⅱ）；RPN7R CGGAATTCCAGGTCAATGACTCGTGATAGCTTCTG（EcoR Ⅰ）；RHD3F GAAGATCTATGGACGCCTGTTTTTCAACACAGCTT（Bgl Ⅱ）；RHD3R CGGAATTCGTGTGCAATCGGGCTTGAATATTCGGGT（EcoR Ⅰ）；RH15F CGAGCTCAAAATGGGCGAAGCTGAGGTCAAGGACAAC（Sca I）； RH15R GCAGTACTCGAAGGCATATATGTCGAAGTATCAAT（Xba Ⅰ）。

2 結果與分析

2.1 BirAGGS3蛋白在水稻原生質體中的蛋白質表達

將pUbi∷BirAG質粒轉化進原生質體中，加入生物素進行培養，作為陽性對照；將pUbi∷BirAG∷GS3質粒轉化兩份原生質體，一份添加生物素，一份不添加，分別作為實驗組和陰性對照組。孵育24 h后，提取原生質體總蛋白，使用兔抗BirA多克隆抗體為一抗進行Westernblot檢測，其中BirAG預測大小為35.29 kDa，BirAGGS3融合蛋白預測大小約為59.62 kDa，與實驗結果相符。實驗結果如圖2所示，表明BirAGGS3融合蛋白成功表達。

2.2 GS3鄰近蛋白在水稻原生質體中的生物素化情況

取三組蛋白樣品，以辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素進行Westernblot檢測（圖3）。圖3結果顯示，陽性對照的BirAG組出現多條條帶，表示其能夠生物素化多種水稻中的蛋白。BirAGGS3在沒有添加生物素的情況下，只出現一條條帶，該條帶為水稻內源生物素化的蛋白。說明在沒有添加生物素的培養液中，BirAGGS3蛋白成功表達但是沒有對周圍蛋白進行生物素化。BirAGGS3 在添加生物素的培養液中，條帶數增加，并且出現了特有的條帶，說明BirAGGS3可以使得鄰近蛋白的生物素化。這表明 BirAGGS3融合蛋白成功生物素化直接或間接相互作用的蛋白。

2.3 GS3鄰近蛋白的質譜鑒定結果

各組的生物素化蛋白經過磁珠富集后進行，經過酶切等后續處理，然后進行LCMS/MS分析。質譜采集到的原始wiff圖譜文件，采用Maxquant軟件進行數據加工處理和檢索分析，將獲得的蛋白制成韋恩圖（圖4）。經過BirAG組和GS3（-）組的過濾，我們發現實驗組GS3（+）特有的蛋白有101個，將這些蛋白導入網站https：//www.ebi.ac.uk/QuickGO，進行基因本體注釋（圖5）。圖5結果顯示，GS3鄰近蛋白參與多個生物學功能，如多種氮類化合物、氨基酸和多肽等的代謝過程。細胞組分方面，GS3鄰近蛋白主要集中在細胞質中，在葉綠體中也有富集。分子功能方面，GS3相關蛋白主要有結構分子活性，同時依賴小分子來調節功能，例如結合各類核苷酸、陰離子等。按照其分子功能，將得到的蛋白進行分類，如表1所示。將這些蛋白導入STRING網站 （http：//stringdb.org，互作蛋白/基因檢索工具），構建GS3鄰近蛋白質互作網絡（圖6）。這表明GS3鄰近的蛋白之間也存在許多實驗證明的或者計算機預測的相互作用。同時可以看出GS3鄰近蛋白在核糖體、卟啉和葉綠素代謝，脂肪酸伸長，乙醛酸和二羧酸代謝，光合作用等途徑發生富集。

2.4 GS3與其鄰近蛋白互作的檢測

挑選了ICL（Isocitrate lyase，異檸檬酸鹽裂解酶）、PPDK1 （Pyruvate phosphate dikinase 1，丙酮酸磷酸雙激酶）、RPN7（26S蛋白酶體的非ATP酶的調節亞基6，26S proteasome nonATPase regulatory subunit 6）、RH15（DEADbox ATPdependent RNA helicase 15，DEAD盒ATP依賴的RNA解旋酶15）和RHD3 （ROOT HAIR DEFECTIVE 3，根毛缺陷蛋白3），通過雙分子熒光互補技術，對過濾后的蛋白進行互作驗證。5個蛋白編號在表2 中已經備注，并用方框標記。擴增這5個基因的CDS，并構建BiFC表達載體。BiFC結果如圖7所示，ICL、PPDK、RPN7和RH15與GS3蛋白發生互作。

3 討論與結論

通過BioID成功得到了101個候選蛋白，本研究挑選了5個進行BiFC初步驗證，鑒定到4個可能與GS3互作的蛋白，分別為ICL、PPDK、RPN7和RH15，這些蛋白涉及多個植物生長生理過程。作為一種快速篩選可能的互作蛋白的方法，BioID 不同于酵母雙雜交，它可以在細胞中檢測到臨近蛋白，也可以檢測瞬時或弱結合蛋白。

ICL和MS（蘋果酸合酶，Malate synthase）是乙醛酸循環中起關鍵作用的限速酶。油料種子通過乙醛酸循環，將脂肪轉化為糖，這對種子的萌發、萌發后的生長有著重要的意義。水稻種子的主要成分是淀粉，所以水稻種子的乙醛酸循環可能參與其他生理反應。在缺氧環境下，植物的呼吸作用受到抑制或阻礙，于是通過乙醇發酵途徑產生NAD+。乙醇發酵途徑能產生許多毒性物質，例如乙醛。正常有生長情況下，ICL和MS幾乎檢測不到，而在水淹條件下迅速上升（Lu et al，2005）。該結果預示GS3可能參與逆境生理。

PPDK1催化丙酮酸和PEP（Phosphoenolpyruvate，磷酸烯醇式丙酮酸）之間的可逆反應。其中，丙酮酸為氨基酸和脂肪酸的合成提供碳骨架。PEP

經過羧化反應后形成OAA（α酮戊二酸）進入三羧酸循環，能進入糖異生途徑。此外，PEP也能與4-磷酸赤蘚糖反應形成莽草酸，莽草酸參與木質素、生物堿合成，同時也是次生代謝中的重要物種。水稻中，PPDK1基因在葉肉細胞中表達量不高，但在籽粒中卻大量表達（Kang et al，2005）。Chastain et al（2006）研究指出，PPDK1是在水稻種子發育過程中而不是在種子發育成熟后發揮功能，其主要通過磷酸化來調控其活性，同時蛋白質降解途徑也參與其中。PPDK1的表達量或者活性降低，會導致籽粒堊白度增加，粒重減輕（Kang et al，2005； Wang et al，2015）。Lappe et al（2018）研究發現，在玉米中PPDK1基因通過調控糖酵解通路，影響胚乳的品質。由此可推測，GS3參與調控胚乳糖代謝途徑。

依賴ATP提供的能量，DEADbox RNA解旋酶（RNA helicases，RHs）幾乎參與RNA轉錄到衰變的所有生物過程，在植物的生長發育、抗逆反應中起重要作用（Linder & FullerPace，2015）。在水稻中，凋亡抑蛋白5（Apoptos isinhibitor5，API5）與AIP1 （API5INTERACTING PROTEIN1）和AIP2 （API5INTERACTING PROTEIN2）形成一個轉錄復合物，誘導半胱氨酸蛋白酶1（Cysteine Protease 1，CP1）的表達。“API5AIP1/2CP1”調控水稻絨氈層降解過程中的細胞凋亡進程 （Li et al，2011）。其中，AIP1與AIP2實質上是ATP依賴的DEADbox RNA解旋酶成員，分別為OsRH56與OsRH15。在擬南芥中，三聚體G蛋白的β亞基下游信號網絡中，發現包括DEADbox蛋白在內的DNA/RNA解旋酶參與其中（Khatri et al，2017）。在水稻中，Gα亞基參與了GA通路，其突變體dl發生矮化，而OsRH2和OsRH34雙突變體表現出了類似的表型，這暗示DEADbox解旋酶可能參與了G蛋白介導的GA信號通路 （Huang et al，2016）。因此，我們猜想AIP2也有可能參與到GS3下游網絡調控。

泛素-蛋白酶體降解系統（ubiquitinproteasome system，UPS）選擇性地降解蛋白質，維持類蛋白質的平衡，由此參與到植物的生長發育與抗逆生理中。26S蛋白酶體由1個20S核心顆粒（CP）和2個19S調節顆粒（RP）組成。RPN7是構成19S顆粒裝配的必要亞基，作為蓋子的組成部分（Collins & Goldberg，2017）。在G蛋白信號網絡中，可以發現26S蛋白酶體參與其中。XLG2直接與FLS2和BIK1相互作用，它與AGB1和AGG1/2的功能一起減弱蛋白酶介導的對BIK1的降解，使其達到最佳的免疫激活（Liang et al，2016）。由此推測，GS3可能可以參與到泛素-蛋白酶體降解系統，進而傳遞信號。在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，發現泛素連接酶SCFUcc1作為代謝開關，調節乙醛酸循環（Nakatsukasa et al，2015）。結合PPDK1與ICL生物學功能，猜測GS3直接參與糖酵解、TCA與乙醛酸循環的調節。

本研究通過BioID技術，成功捕獲了GS3的鄰近蛋白，并構建了這些蛋白的互作網絡。BiFC結果表明在選取的5個GS3鄰近蛋白中，有4個蛋白與之互作，分別為ICL、PPDK、RPN7和RH15，涉及能量代謝的調節、種子淀粉物質的儲存、泛素-蛋白酶體系統以及凋亡途徑等生物過程，為構建植物異源三聚體G蛋白網路提供了線索，也為水稻的增產提供了新思路。由于本研究實驗系統采用的是水稻葉肉原生質體，捕獲的蛋白可能具有局限性。我們正在探索以整株轉基因植物為材料進行BioID 技術，以便能在不同的組織、細胞類型中更全面地篩選目標蛋白的互作蛋白。

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