GSTP1rs1695基因多態性與自體造血干細胞移植患者血液學毒性的關系研究

張關敏 劉衛平 馬旭 朱軍 王小沛 張艷華

中圖分類號 Q786；R446.11 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）07-0980-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.07.28

摘 要 目的：研究GSTP1（rs1695）（簡稱GSTP1）基因多態性與自體造血干細胞移植患者使用CBV方案（環磷酰胺、卡莫司汀、依托泊苷）預處理后血液學毒性之間的關系。方法：對2015年4月-2017年6月到我院治療的83例使用CBV方案預處理的自體造血干細胞移植患者進行回顧性分析，采用熒光染色原位雜交檢測法測定GSTP1 A313G的多態性，統計血液學毒性和粒細胞缺乏性發熱發生率以及白細胞、中性粒細胞、血小板植入時間，分析GSTP1基因與上述指標之間的關系。結果：83例患者中28例（33.73%）存在有至少1個基因位點的變異，A等位基因頻率為81.3%，G等位基因頻率為18.7%。GSTP1 AA基因型患者發生Ⅳ度白細胞、Ⅳ度中性粒細胞、Ⅳ度血小板減少的時間分別為化療后（8.91±1.25）、（9.02±1.19）、（11.56±1.58） d，攜帶GSTP1 313等位基因G（AG/GG基因型）的患者減少的時間分別為化療后（8.61±1.17）、（8.68±1.19）、（11.44±1.34） d。GSTP1 AA基因型患者白細胞、中性粒細胞、血小板的植入時間分別為自體造血干細胞回輸后（11.98±1.99）、（10.44±1.35）、（15.55±2.18） d；攜帶GSTP1 313等位基因G（AG/GG基因型）的患者植入時間分別為自體造血干細胞回輸后（12.41±2.44）、（10.36±1.62）、（16.29±3.15） d。GSTP1 AA基因型及攜帶GSTP1 313等位基因G（AG/GG基因型）的患者移植期間發生Ⅲ～Ⅳ度貧血的患者分別為24、11例，分別占對應基因型患者的43.64%、39.29%；發生粒細胞缺乏性發熱的分別為21、11例，分別占對應基因型患者的38.18%、39.29%，但上述差異均無統計學意義（P>0.05）。結論：GSTP1基因多態性與自體造血干細胞移植患者使用CBV方案預處理后的血液學毒性未見相關性，亦不影響干細胞植入時間。

關鍵詞 GSTP1（rs1695）；基因多態性；CBV方案；自體造血干細胞移植；血液學毒性

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the relationship of GSTP1 （rs1695） （simply as GSTP1） gene polymorphism with the hematological toxicity in autologous hematopoietic stem cell transplantation （AHSCT） patients who used CBV regimen （cyclophosphamide， carmustine， etoposide）. METHODS： A total of 83 AHSCT patients receiving CBV regimen were retrospective analyzed in our hospital during Apr. 2015-Jun. 2017. The gene polymorphism of GSTP1 A313G was detected by fluorescence staining in situ hybridization. The hematological toxicity and the incidence of agranulocytosis fever， the implantation time of leukocyte， neutrophils and platelet were analyzed statistically. The relationship of GSTP1 with above indexes were analyzed. RESULTS： Among 83 patients， gene variation was observed in one gene loci at least of 28 patients （33.73%）. The gene frequency of A allele was 81.3%， while that of G allele was 18.7%. The reduce time of Ⅳ grade leukopenia， Ⅳ grade neutropenia and Ⅳ grade thrombocytopenia in GSTP1 AA genotype patients were （8.91±1.25），（9.02±1.19）， （11.56±1.58） d after chemotherapy； those of patients with GSTP1 313 allele G （AG/GG genotype） were （8.61±1.17）， （8.68±1.19）， （11.44±1.34） d after chemotherapy. The implantation time of leukocyte， neutrophils and platelet in patients with GSTP1 AA genotype were （11.98±1.99），（10.44±1.35），（15.55±2.18） d after autologus peripheral blood stem cell reinfusion； those of patients with GSTP1 313 allele G （AG/GG genotype） were （12.41±2.44），（10.36±1.62），（16.29±3.15） d after autologus peripheral blood stem cell reinfusion. The case number of grade Ⅲ-Ⅳ anemia were 24 and 11， accounting for 43.64% and 39.29% of corresponding genotype patients. The case number of agranulocytosis fever in patients with GSTP1 AA genotype or GSTP1 313 allele G （AG/GG genotype） were 21 and 11 during transplantation， accounting for 38.18% and 39.29% of corresponding genotype patients， respectively， without statistical significantly （P>0.05）. CONCLUSIONS： There is no relationship between GSTP1 gene polymorphism and hematological toxicity of AHSCT patients receiving CBV regimen.

KEYWORDS GSTP1； Gene polymorphism； CBV regimen； Autologous hematopoietic stem cell transplantation； Hematological toxicity

大劑量化療聯合自體造血干細胞移植是晚期淋巴瘤的鞏固治療手段，也是復發難治淋巴瘤的挽救治療方法，能夠延長患者的生存期、提高患者的生活質量[1]。含有環磷酰胺的預處理方案，如BuCy方案（白消安、環磷酰胺）及CBV方案（環磷酰胺、卡莫司汀、依托泊苷）等是造血干細胞移植前常用的預處理化療方案[2-3]，常見的不良反應有骨髓抑制、消化道反應、感染等。

環磷酰胺是一種無活性的前藥，在體內首先經細胞色素P450酶（CYP）系代謝活化，生成4-羥基環磷酰胺（4-OHCPA）而發揮細胞毒作用，4-OHCPA可進一步轉化為磷酰胺氮芥和丙烯醛，4-OHCPA及磷酰胺氮芥在谷胱甘肽S-轉移酶（GSTs）的催化下，與谷胱甘肽形成水溶性復合物從尿液或膽汁中排出體外[4]。已有研究表明，GSTP1（rs1695）（下文簡稱GSTP1）313位點由A突變為G可影響GSTs的表達及活性，使環磷酰胺及其代謝產物的排泄減少，在體內蓄積增加，導致患者療效及不良反應之間出現差異[5-6]。本研究以接受CBV方案預處理化療的自體造血干細胞移植患者為研究對象，探討GSTP1 A313G基因多態性與患者血液學毒性之間的關系，旨在為臨床應用提供參考。

1 資料來源與方法

1.1 病例資料

對2015年4月-2017年6月在北京大學腫瘤醫院接受自體造血干細胞移植的淋巴瘤患者進行回顧性分析，所有患者根據2008年世界衛生組織（WHO）淋巴瘤診斷標準[7]，經病理活檢確診為淋巴瘤。按照Ann-Arbor淋巴瘤分期標準[8]，將患者分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期。

1.2 治療方法

所有患者均給予大劑量預處理化療聯合自體造血干細胞移植治療。將患者自體造血干細胞回輸的時間定義為第0天。預處理采用CBV方案：環磷酰胺 1.25 g/m2（-5～-2 d），卡莫司汀 300 mg/m2（-6 d），依托泊苷 200 mg/m2（-5～-2 d）。

1.3 DNA序列測定方法

采用熒光染色原位雜交檢測法進行檢測。具體方法：抽取患者外周靜脈血2 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，取150 μL血加入1 mL紅細胞裂解液，靜置5 min；使用Scilogex D2012型離心機離心5 min，棄上清，加入核酸純化試劑（北京華夏時代基因科技發展有限公司），混勻后加入相應位點的測序反應通用試劑（北京華夏時代基因科技發展有限公司），采用TL988A型雙通道實時熒光定量檢測儀（西安天隆科技有限公司）檢測GSTP1 A313G位點基因多態性。

1.4 觀察指標

查閱病例資料，統計患者Ⅳ度白細胞減少、Ⅳ度中性粒細胞減少、Ⅳ度血小板減少的發生率、發生時間以及白細胞、中性粒細胞和血小板的植入時間。記錄患者貧血分級，以及是否發生粒細胞缺乏性發熱，并計算Ⅲ～Ⅳ度貧血的發生率。

根據2009年美國國立癌癥研究所（National Cancer Institute， NCI）制定的不良事件通用術語標準（CTCAE， 4.0版）[9]，Ⅳ度白細胞減少定義為：白細胞計數<1×109 L-1；Ⅳ度中性粒細胞減少的定義為：中性粒細胞計數<0.5×109 L-1；Ⅳ度血小板減少定義為血小板計數<25×109 L-1。白細胞、中性粒細胞、血小板植入時間的定義為：從自體造血干細胞回輸開始白細胞計數連續3 d>4×109 L-1的第1天、中性粒細胞計數連續3 d>0.5×109 L-1的第1天：從自體造血干細胞回輸開始血小板計數連續3 d>20.0×109 L-1的第1天（在此前1周內未輸注血小板的前提下）。貧血判斷標準：Ⅰ度為血紅蛋白低于正常參考值下限且≥100 g/L，Ⅱ度為血紅蛋白<100且≥80 g/L，Ⅲ度血紅蛋白<80且≥65 g/L，Ⅳ度為血紅蛋白<65 g/L。粒細胞缺乏性發熱的定義為：中性粒細胞計數<0.5×109 L-1，同時單次口溫超過38.3 ℃或超過38.0 ℃高于1 h。

1.5 統計學方法

使用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析，對GSTP1 A313G基因型及等位基因頻率進行χ2檢驗，判斷等位基因頻率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，檢驗水準α=0.05，P>0.05表示所研究群體符合Hardy-Weinberg平衡定律。其余計量資料采用t檢驗和Mann-Whitney檢驗，計數資料采用χ2檢驗，以P<0.05（雙側）為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者一般資料

共有83例患者納入研究，其中男性59例、女性24例；中位年齡37歲（14～63歲）；診斷為霍奇金淋巴瘤24例、非霍奇金淋巴瘤59例（其中B細胞淋巴瘤48例、T細胞淋巴瘤11例）。確診時Ann-Arbor分期患者：Ⅰ期4例、Ⅱ期11例、Ⅲ期17例、Ⅳ期51例。35例（42.2%）存在盜汗、發熱和體質量減輕的癥狀。患者基線資料見表1。

2.2 GSTP1基因多態性

83例患者GSTP1基因的313位堿基，A等位基因頻率為81.3%，G 等位基因頻率為18.7%。28例（33.73%）患者至少存在1個位點變異。檢測結果經Hardy-Weinberg檢驗，P>0.05，說明各基因型頻率達到遺傳平衡，研究資料具有群體代表性，患者GSTP1基因型分布詳見表2。

2.3 基因多態性對血液學毒性的影響

83例患者均出現Ⅳ度白細胞減少及Ⅳ度中性粒細胞減少，79例患者（AA基因型52例、AG基因型24例、GG基因型3例）出現Ⅳ度血小板減少；48例患者（AA基因型31例、AG基因型15例、GG基因型2例）出現Ⅰ～Ⅱ度貧血，35例患者（AA基因型24例、AG基因型10例、GG基因型1例）出現Ⅲ～Ⅳ度貧血；32例患者（AA基因型21例、AG基因型11例）出現粒細胞缺乏性發熱；AA基因型患者與攜帶GSTP1 313等位基因G（AG/GG基因型）患者比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。患者使用CBV方案預處理后血液學毒性與GSTP1基因多態性的關系見表3。

AA基因型患者發生Ⅳ度白細胞、Ⅳ度中性粒細胞、Ⅳ度血小板減少的時間與攜帶GSTP1 313等位基因G（AG/GG基因型）患者比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。患者使用CBV方案預處理后血液學毒性發生時間與GSTP1基因多態性的關系見表4。

可獲得白細胞植入時間、中性粒細胞植入時間、血小板植入時間資料的患者分別為80、83、30例。對上述數據進行統計分析，AA基因型患者白細胞植入時間、中性粒細胞植入時間、血小板植入時間與攜帶GSTP1 313等位基因G（AG/GG基因型）患者比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。患者使用CBV方案預處理后干細胞植入時間與GSTP1基因多態性的關系見表5。

3 討論

GSTP1 A313G（Ile>Val）是目前研究較為廣泛的單核苷酸多態性之一，該突變與環磷酰胺療效及不良反應之間的關系目前尚未得出一致結論。有研究認為攜帶GSTP1 313等位基因G的患者，由于GSTP1酶活性下降，對環磷酰胺及其活性代謝產物的清除變慢，在導致臨床療效提高的同時，也顯著升高了骨髓抑制等不良反應的發生率[10-11]。Islam MS等[12]研究發現，在使用環磷酰胺+表柔比星+氟尿嘧啶方案化療的乳腺癌患者中，攜帶GSTP1 313等位基因G（AG/GG基因型）的患者的生存率高于AA基因型患者，但不同基因型患者之間的不良反應差異并無統計學意義。Sugishita M等[13]在一項單中心回顧性研究中得出了相反的結論：在使用含環磷酰胺化療方案的乳腺癌患者中，GSTP1 AA基因型患者發生粒細胞缺乏性發熱的風險高于AG、GG基因型患者。Jamieson D等[14]的研究則表明，GSTP1基因多態性對環磷酰胺的藥動學參數無顯著影響。

目前尚無造血干細胞移植患者中的GSTP1基因多態性與環磷酰胺不良反應相關性之間的文獻報道。本研究中，GSTP1 313位攜帶等位基因G的患者Ⅳ度骨髓抑制的發生時間早于AA基因型患者，白細胞、血小板植入時間均長于AA基因型患者，未觀察到上述差異的統計學意義。分析可能的原因有以下幾點：環磷酰胺體內代謝過程受CYP、GSTs等酶的影響，GSTP1僅為影響其體內過程的多種酶之一；移植預處理方案除環磷酰胺外，還有卡莫司汀、依托泊苷兩個藥物對血液學毒性也會產生影響；自體造血干細胞移植患者所使用的預處理方案劑量強度較高，血液學毒性發生率高于普通化療方案，無法判斷GSTP1基因型與血液學毒性發生率之間的相關性。

本研究樣本量較小，下一步可設計前瞻性隨機對照研究，增加樣本量，考察可能影響環磷酰胺體內代謝及排泄的其他基因位點數據，排除混雜因素的影響，以期得出明確結論。

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（收稿日期：2017-11-07 修回日期：2018-02-01）

（編輯：鄒麗娟）