補腎藥膳方對絕經后骨質疏松癥模型大鼠CTX—Ⅰ指標及骨組織形態的影響

林靜 張潔 陳燕

〔摘要〕 目的 觀察補腎藥膳方對絕經后骨質疏松癥（PMOP）模型大鼠Ⅰ型膠原C端肽（CTX-Ⅰ）指標及骨組織形態的影響。方法 SPF級雌性SD大鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組、補腎藥膳方高劑量組、補腎藥膳方低劑量組、骨疏康組，每組10只。除正常組、假手術組外，其他組大鼠進行雙側卵巢摘除，適應性飼養15 d后，分組干預12周，ELISA法檢測血清中骨代謝標志物CTX-Ⅰ濃度表達情況，HE染色鏡下觀察骨組織形態。結果 與正常組和假手術組比較，模型組、補腎藥膳方高、低劑量組、骨疏康組大鼠血清CTX-Ⅰ濃度均升高（P<0.05）；與模型組比較，補腎藥膳方高劑量組、低劑量組、骨疏康組血清CTX-Ⅰ濃度顯著降低（P<0.05），低劑量組血清CTX-Ⅰ濃度雖低于高劑量組、骨疏康組，但差異無統計學意義（P>0.05）。在骨形態上，模型組骨小梁明顯變細，出現明顯斷裂，有扭曲，形態結構差，骨小梁間的間隙增大，骨髓腔擴大融合明顯，高劑量組、低劑量組與骨疏康組均能一定程度上改善骨形態。結論 補腎藥膳方各劑量對CTX-I濃度的影響與骨疏康顆粒療效相當，一定程度能降低骨吸收標志物水平，減少骨吸收，改善骨形態，緩解骨質疏松，但在劑量精確方面仍可待將來研究。

〔關鍵詞〕 補腎藥膳方；絕經后骨質疏松；CTX-Ⅰ指標；骨形態

〔中圖分類號〕R285.5；R681 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.04.006

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of reinforcing kidney medicinal diet on CTX-Ⅰindex and bone morphological changes in postmenopausal osteoporosis （PMOP） model rats. Methods SPF female SD rats were randomly divided into normal group， sham operation group， model blank group， high dose group， low dose group and Gushukang group， with 10 rats in each group. Except normal group and sham operation group， other rats were ovariectomized. After 15 days of adaptive feeding， the rats were given intervention treatment for 12 weeks. The expression of CTX-Ⅰ in serum was detected by ELISA method. Bone morphology was observed by HE staining. Results Compared with the normal group and sham-operation group， the concentration of CTX-Ⅰin model blank group， high dose group， low dose group， Gushukang group increased significantly （P<0.05）. Compared with the model blank group， the concentration of CTX-Ⅰ in high dose group， low dose group and Gushukang group decreased significantly （P<0.05）. CTX-1 in low dose group was lower than the high dose group and Gushukang group， but the difference between them was not significant（P>0.05）. In the bone morphology， the trabecular bone of the model blank group was significantly thinner， with obvious fracture， twisting， poor shape and structure， increased gap between the trabecular bone and bone marrow cavity. The bone marrow cavity expanded and merged obviously. The high dose group， the low dose group and the Gushukang group could improve bone morphology to some extent. Conclusion The effect of reinforcing kidney medical diet on the concentration of CTX-I is comparable with that of Gushukang granules. It could reduce the level of bone resorption markers， reduce bone resorption， improve bone shape and alleviate osteoporosis to a certain extent. The accuracy of dose should be further studied.

〔Keywords〕 rreinforcing kidney medicinal diet； postmenopausal osteoporosis； CTX-Ⅰindex； bone morphology

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是以骨量降低和骨結構退化為特點，危害中老年健康的全身骨代謝疾病[1]。婦女絕經后，導致骨質疏松的主要原因是天癸漸竭，腎氣漸衰，骨髓化生無源，致筋骨不堅，髓枯骨脆[2]。因此研究抗骨質疏松藥物可以從補腎藥物著手。WHO明確提出治療骨質疏松癥應從補鈣、運動與飲食方面著手，其中飲食療法是防治骨質疏松的重要方案。隨著中醫理論的發展，有學者根據“腎主藏精”理論進行實驗研究，認為補腎中藥對OP各個病理環節有著一定的調節作用，杜仲、牛膝等中藥對抗骨質疏松作用有增強趨勢[3-4]。目前有研究認為[5-6]藥膳方能夠有效地防治絕經后骨質疏松，操作便利，既可治療和保健，又可調養身心。為進一步探討補腎藥膳方在防治絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）中的作用，本實驗采用經過專家認定的補腎藥膳方治療絕經后骨質疏松模型大鼠，觀察其對大鼠血清I型膠原C端肽（CTX-I）濃度及骨組織形態的影響，探討其對絕經后骨質疏松模型大鼠的干預作用。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

SPF級雌性SD大鼠60只（4～5月齡，未曾交配，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司），體質量200～220 g，所有SPF級大鼠喂養在恒溫恒濕的清潔環境中，環境溫度為（25±1） ℃，濕度為70%，每天12小時光照/黑暗，進食大鼠標準飼料和凈化水。對每只大鼠進行編號，按隨機數字表進行分組，共分為6組，每組10只。第一組為正常組，第二組為假手術組，第三組為模型組，第四組為補腎藥膳方高劑量藥膳組，第五組為補腎藥膳方低劑量藥膳組，第六組為骨疏康顆粒組，所有動物均適應性飼養1周。

1.2 實驗藥物

實驗組：補腎藥膳方食材：狗肉200 g，羊腎150 g，山藥30 g，枸杞30 g，由湖南省中醫藥研究院附屬醫院提供。將上述食材清水洗凈后放入砂鍋，食材再加水2 000 mL，武火煮沸后，改用文火煲1 h，取湯汁，食材再加水煎煮1次，合并兩次煎煮湯汁，加熱濃縮至100 mL備用，為高劑量。

對照組：骨疏康顆粒，遼寧康辰藥業有限公司，批準文號：國藥準字Z20033255。成分是淫羊藿、熟地黃、骨碎補、黃芪、丹參、木耳、黃瓜籽，20 g/d用于治療腎虛，氣血不足所致的中老年骨質疏松癥，伴有腰脊酸痛，足膝酸軟，神疲乏力。

藥膳及藥物準備均在湖南省中醫藥研究院附屬醫院中心實驗室完成。

1.3 PMOP模型的建立

所有動物適應性飼養1周后進行造模，除正常組外，模型組、高劑量藥膳組、低劑量藥膳組、骨疏康組均用10%水合氯醛（0.4 mL/100 g），腹腔注射麻醉大鼠，無菌條件下從下腹部進入腹腔，完整摘除雙側卵巢，切下卵巢送病理科經病理切片證實卵巢正常。假手術組與模型組處理相同，但不切除雙側卵巢，僅切除卵巢周圍等體積的脂肪。對進行手術的大鼠仔細止血，逐層縫合，并用青霉素（0.8 mL/250 g）腹腔注射3 d進行抗感染治療。

1.4 動物灌胃、觀察、取材

造模15 d后灌胃12周，正常組和假手術組、模型空白組用一般飼料飼養，藥膳組用補腎藥膳方灌胃，骨疏康顆粒組用骨疏康灌胃。陽性對照組和實驗組用藥劑量按人體給藥劑量的6.0倍計算[7]。高劑量組：濃縮補腎藥膳方湯汁100 mL，每mL含藥膳4.1 g，折算大鼠的給藥劑量為41 g/kg·d；低劑量組：在高劑量組的基礎上等比遞減，每mL含藥膳2.05 g，折算大鼠的給藥劑量為20.5 g/kg·d；骨疏康顆粒組：骨疏康顆粒成人1 d為20 g，折算大鼠的給藥劑量為2 g/kg·d。

實驗過程中大鼠出現的死亡情況：模型組灌胃致死2只，高劑量組灌胃致死1只，標本采集前共57只。大鼠在最后一次灌胃后禁食24 h，處死后立即取材。用10%水合氯醛腹腔注射進行麻醉（0.4 mL/100 g），麻醉后用碘伏消毒手術部位，消毒手術剪剪開腹腔，采集標本。

用一次性采血針采集靜脈血。暴露腹主動脈沿下腔靜脈方向采血，取血量：8 mL/只，血液在不含抗凝劑的試管中低溫（4 ℃）靜置4 h后低溫離心，3 000 g×30 min，取上層血清，按組別分裝，于-80 ℃超低溫冰箱保存，用來檢測CTX-I。

1.5 實驗方法

采用ELISA法檢測大鼠血清I型膠原C端肽（CTX-I）的含量水平。實驗前將試劑盒及待測樣本放置室溫平衡20 min。分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔，空白孔加樣品稀釋液100 μL，余孔分別加標準品或待測樣品100 μL。37 ℃孵育90 min棄去液體，甩干，每孔加入生物素化抗體工作液100 μL。37 ℃溫育1 h，棄去孔內液體，甩干并用配制好的濃縮洗滌液洗板3次，每孔加入酶結合工作液100 μL。37 ℃溫育30 min，棄去孔內液體，甩干并洗板5次。每孔加底物溶液90 μL，37 ℃避光溫育15 min，當標準孔顯示明顯梯度時，每孔加終止液50 μL，終止反應。用酶標儀在450 nm波長測量各孔的光密度（OD值）。以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線，得出標準方程，根據方程計算每個樣本的濃度。病理切片統一采用光鏡下采圖并分析圖像。

1.6 統計學方法

應用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，劑量數據用“x±s”表示，符合正態分布者采用單因素方差分析及多重比較，不符合正態分布者采用秩和檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EIISA法檢測各組大鼠血清CTX-I濃度表達

與正常組和假手術組比較，模型組（高、低）劑量組，骨疏康組CTX-I濃度均升高（P<0.05），與模型組比較，補腎藥膳方高劑量組、補腎藥膳方低劑量組、骨疏康組CTX-I濃度均降低（P<0.05）；補腎藥膳方高、低劑量組、骨疏康組CTX-I濃度比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2 大鼠右股骨石蠟切片HE染色顯微形態

正常組：光鏡顯示骨小梁排列整齊、規則并連接成網，形態結構完整，骨髓腔大小正常。假手術組：光鏡顯示骨小梁排列整齊、規則并連接成網，形態結構完整，骨髓腔大小正常，與正常組類似。模型組：骨小梁明顯變細，出現明顯斷裂，有扭曲，形態結構差，骨小梁間的間隙增大，骨髓腔擴大融合明顯。高劑量組：與模型組比較，光鏡顯示骨小梁排列稍微規則，斷裂少，部分區域骨小梁間的間隙增大小于模型組，骨髓腔稍有擴大。低劑量組：與模型組比較，光鏡顯示骨小梁排列規則，斷裂很少，形態結構接近正常，骨髓腔大小較正常。骨疏康組：與模型組比較，光鏡顯示骨小梁排列規則，斷裂很少，形態結構接近正常，骨髓腔大小較正常，與低劑量組類似。見圖1。

3 討論

骨質疏松癥是現代醫學名，在中醫古文獻中并無“骨質疏松”病名。但骨質疏松所表現的腰背疼痛、頭眼昏花、易發生骨折等臨床表現及發病機制與中醫學中“骨枯而髓減，發為骨痿”論述極為相似，因此通常將此病認為是“骨痿”“骨痹”的范疇[8]。《黃帝內經》謂骨痿“骨枯而髓減”，謂骨痹“腎脂枯不長”，并未描述二者之間的不同。《金匱要略》中認為骨痹是骨痿的進一步發展。張從正從臨床表現說明了兩者的不同，認為關節疼痛為主屬于骨痹，軟弱無力屬于骨痿，指出骨痿與骨痹應當區分來論治，提出以其寒熱區別病之新舊。這些論述對于進一步認識骨質疏松與骨痿、骨痹間的關系均有一定的參考價值。目前大多數研究者認為絕經后骨質疏松仍舊屬于“骨痿”的范疇[9-10]。

目前PMOP公認的發病機制主要是腎虛[11-12]。中醫學認為PMOP的發生與腎臟關系密切，腎藏精，為先天之本，主骨主生髓，髓以養骨，骨的生發依賴于腎氣的滋養。“腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發為骨痿”，“……腎病則骨極，牙齒苦痛，手足疼，不能久立，屈伸不利……”，“髓者，腎精所生，精足則髓足，髓在骨內，髓足則骨強……”，以上中醫理論均認為腎精氣盛衰與骨強勁與否有著根本的聯系，若腎虛，骨髓便不能濡養骨骼，骨骼軟脆無力，出現疼痛，引發骨質疏松。腎主宰著人體的生長發育、生殖與女性的月經潮止，女子二七而潮，七七而絕，說明隨著年齡的增長腎精氣由盛轉衰，骨骼得不到充分的濡養，易造成骨質丟失，引發骨質疏松。因此補腎是防治骨質疏松的基本立足點[13]。

本研究為保障實驗同質性，經咨詢專家對食材予以組方：狗肉，羊腎，山藥，枸杞。狗肉為主藥，狗肉味咸、酸，性溫，有溫腎壯陽，助氣力、補血脈的功效，且含有豐富的蛋白質，容易吸收；羊腎為臣藥，羊腎味甘，性溫，補腎氣、益精髓；山藥和枸杞各為佐使藥，山藥性味甘、平，補脾養胃，益腎澀精；枸杞性味甘、平，養肝滋腎。以動物類補腎藥為主，植物類補腎藥為輔，相互補充，增強療效，全方共奏補腎強骨生髓之效。陽性對照組選取骨疏康進行灌胃，有骨疏顆粒的前期研究表明其能有效治療OP，是常用的臨床經驗用方[14]。

大鼠的骨變化與人類有較多相似之處，目前公認與臨床最接近的絕經后骨質疏松動物模型是去卵巢大鼠模型。去勢后的大鼠雌激素缺乏致骨轉換率增加，成骨速率小于骨吸收速率，骨代謝平衡被破壞，單位體積內骨組織量減少[15]。所以本研究對雌性大鼠適應性飼養后切除大鼠雙側卵巢，導致大鼠雌激素水平降低，模擬由于雌激素水平缺乏而引起PMOP的臨床特征，實質是復制婦女絕經后骨質疏松模型。本研究顯示，造模3個月后，與正常組和假手術比較，模型組、高劑量組、低劑量組、骨疏康組血清CTX-Ⅰ濃度均升高（P<0.05）；各組實驗大鼠股骨在HE染色光鏡下形態也發生了變化，骨小梁明顯變細，出現明顯斷裂，有扭曲，形態結構差，骨小梁間的間隙增大，骨髓腔擴大融合明顯，認為絕經后骨質疏松癥大鼠造模成功。

在PMOP的診斷、治療過程中，血清骨代謝指標變化早于BMD的改變，有助于早期發現OP和風險評估，是其診斷、判斷療效和調整治療方案有效而簡便的方法[16]。近年，作為骨吸收指標I型膠原降解時產生的末端肽及吡啶交聯物備受關注，I型膠原被降解量較少，當骨代謝正常時，血中能檢測到的含量極微[17]。研究表明[18]I型膠原C端肽（CTX-I）是代表性較強的骨吸收標志物之一，當破骨細胞活性增強時，I型膠原降解也增高，導致骨轉換加快，血中CTX-I水平明顯升高。本實驗研究發現：與模型組比較，高劑量組、低劑量組、骨疏康組血清CTX-Ⅰ濃度顯著降低（P<0.05），補腎藥膳方、骨疏康顆粒干預可降低PMOP大鼠血清CTX-Ⅰ濃度。其中低劑量組血清CTX-Ⅰ濃度雖低于高劑量組、骨疏康組，但差異不存在統計學意義（P>0.05），可認為補腎藥膳方各劑量之間對CTX-I濃度無明顯影響，與骨疏康顆粒療效相當。

4 小結

隨著我國進入老齡化社會，OP患者越來越多，合并骨折等并發癥發病率不斷增加，已成為老年人尤其是絕經后女性常見的疾病之一，嚴重影響了其活動能力和生活質量[19]。女性絕經后，雌激素水平急劇下降，骨重建失衡，加速骨量流失，導致骨質疏松。而PMOP發病機制復雜，治療方法眾多，目前應用的西藥雖能取得良好的效果，但副作用較多，如胃腸道不良反應、肝腎毒性等，甚至可產生耐藥性，費用也較昂貴[20]，因此尋求更為安全、有效、經濟適用的防治方法是臨床亟待解決的問題。本實驗以中醫“腎主藏精”理念為引導，依據“藥食同源”觀點，用經過專家認定的補腎藥膳方干預PMOP模型大鼠，觀察其對大鼠血清CTX-I濃度及骨形態的影響，為以后臨床上選擇科學有效的防治方案提供參考依據，而補腎藥膳方的食、藥材具有物美價廉、方便易取、易烹調、口感好的優點，值得提倡。

參考文獻：

[1] 薛 延.骨質疏松癥防治指南[M].北京：人民衛生出版社，2008：3-13.

[2] 張 瑤，張維麗，馬 威，等.補腎健脾湯對去卵巢骨質疏松模型大鼠骨代謝指標的影響[J].中華中醫藥雜志，2016，31（3）：864-867.

[3] 鄧洋洋，孫 鑫，李 佳，等.去卵巢骨質疏松癥模型大鼠股骨、腎、下丘腦smurf1信號轉導蛋白的活性變化研究[J].中華中醫藥雜志，2014，29（2）：2574-2577.

[4] 高衛輝，向艷華，劉 云，等.中藥杜仲-牛膝配伍對去卵巢大鼠骨質疏松癥的干預實驗研究[J].湖南中醫藥大學學報，2016，36（6）：43-46.

[5] 許東晨.中醫食療對老年骨質疏松癥患者臨床癥狀和骨密度影響研究[J].中醫臨床研究，2014，6（33）：101-102.

[6] 林 靜，梁百慧，方 森，等.食療對腎虛型骨質疏松癥作用的研究進展[J].護理研究，2017，31（13）：1561-1563.

[7] 魏 偉，吳希美.藥理實驗方法學[M].北京：人民衛生出版社，2010：7.

[8] 申 浩，魏 戌，謝雁鳴，等.絕經后骨質疏松癥骨折危險因素及中醫癥狀相關性研究[J].中國中西醫結合雜志，2017，37（1）：50-56.

[9] 魯尚德.骨質疏松癥病因病機研究概況[J].世界最新醫學信息文摘，2016，16（38）：44-45，51.

[10] 秦 臻，任艷玲.從“精不足者補之以味”探討絕經后骨質疏松癥的防治[J].中醫雜志，2017，58（12）：1021-1023.

[11] 吳鑫宇，李 冀.骨質疏松癥的中醫臨床方藥研究進展[J].中醫藥學報，2013，41（4）：128-130.

[12] 陳 易，王明三，徐琬梨.絕經后骨質疏松癥證型探討[J].遼寧中醫雜志，2017，44（2）：273-275.

[13] 宋 敏，李澤佳，董萬濤，等.基于“補腎法”治療原發性骨質疏松癥的研究述評[J].中國骨質疏松雜志，2014，20（8）：973-977.

[14] 郭文清.骨疏顆粒對骨質疏松大鼠骨代謝指標及炎癥因子的影響[D].昆明：云南中醫學院，2016.

[15] 梁文娜，李西海，李亞嬋，等.基于證素辨證探討絕經后骨質疏松癥中醫病理狀態辨識[J].中華中醫藥雜志，2016，31（1）：72-74.

[16] 張萌萌，張艷會，毛未賢，等.1 084例女性TRACP、CTX-1、BALP、BGP、鈣磷代謝指標與BMD相關性[J].中國骨質疏松雜志，2013，19（9）：902-906.

[17] 楊永紅，魯 力，夏鳳瓊，等.老年血清骨代謝物骨鈣素、Ⅰ型膠原C端肽、骨源性堿性磷酸酶與骨密度的相關性[J].中國老年學雜志，2016，36（20）：5112-5113.

[18] THUDIUM C S， MOSCATELLI I， FLORES C， et al. A Comparison of osteoclast-rich and osteoclast-poor osteopetrosis in adult mice sheds light on the role of the osteoclast in Coupling bone resorption and bone formation[J]. Calcified Tissue International，2014，95（1）：83-93.

[19] 江 婷，方朝暉.中醫藥治療骨質疏松癥研究現狀及進展[J].中醫藥臨床雜志，2014，26（5）：543-545.

[20] 王柄棋，孫雨晴，陳 翔，等.絕經后骨質疏松癥藥物治療的現狀與思考[J].中國骨質疏松雜志，2017，23（6）：818-823.