窄葉鮮卑花提取物的抗氧化活性研究

陳葉 馬銀山 羅光宏 焦楊

[摘要]目的：以綠茶為對(duì)照，研究了窄葉鮮卑花果穗和葉粗提取物的抗氧化活性及還原能力。方法：采用DPPH、ABTS自由基清除活性和Fe3+還原法對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究。結(jié)果：窄葉鮮卑花果穗中多糖、多酚、黃酮的提取率分別是40.3%、45.2%和21.7%，葉中提取率分別是52.3%、64.7%和29.8%，且葉提取物的多糖、多酚、黃酮含量均高于果穗。綠茶提取物中黃酮和多酚對(duì)清除DPPH、ABTS自由基起主要作用，而黃酮、多糖在果穗提取物清除DPPH自由基和葉提取物清除ABTS自由基時(shí)起主要作用；窄葉鮮卑花中脂類物質(zhì)質(zhì)量濃度小于0.4 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH、ABTS自由基清除效果較好。果穗和葉提取物的還原能力差異較小，且兩者中多酚的還原能力隨濃度呈較好的量效關(guān)系，而多糖和黃酮的還原能力隨濃度增加其增幅不大，說(shuō)明果穗和葉中具有還原能力的物質(zhì)主要是多酚。結(jié)論：窄葉鮮卑花果穗和葉具有一定的抗氧化能力，且葉優(yōu)于果穗。

[關(guān)鍵詞]窄葉鮮卑花；提取物；自由基清除率；抗氧化

[中圖分類號(hào)]Q 945[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號(hào)]1005-0310（2018）03-0052-07

Abstract： Objective：To study the antioxidative activity and reducing ability of crude extracts from the ear and leaf of Sibiraea Augustata， using green tea as a control. Method：The antioxidant activity is studied using DPPH， ABTS free radical scavenging activity and Fe3+ reduction method. Results：The extraction rate of polysaccharides， polyphenols and flavone are 40.3%， 45.2% and 21.7% from ear， and 52.3%， 64.7% and 29.8% from leaf. Further， the extracts of the leaf were higher than that of the ear from Sibiraea Angustata. Polyphenol and flavone of Green Tea play a major role in eliminating the free radicals of DPPH and ABTS， while flavone and polysaccharides from ear of Sibiraea Angustata play a major role in scavenging DPPH free radicals and extracting ABTS free radicals from leaf extracts. When the concentration of lipids is less than 0.4mg/mL， the scavenging effect is better on DPPH and ABTS free radical. The reduction ability of the extracts of the ear and leaf was small， and the reducing ability of the polyphenols in the two shows a good dose-effect relationship with the concentration， while the reducing ability of the polysaccharides and flavonoids increased slightly with increasing concentrations， indicating that the polyphenols in the ear and leaf are the main substances that have the reducing power. Conclusion：The leaf and ear of Sibiraea Angustata have certain antioxidant capacity， and the leaf is better than the ear.

Keywords： Sibiraea Angustata； Extract； Antioxidant activity； Antioxidant

窄葉鮮卑花（sibiraea angustata （Rehd.）Hand.Mazz.） 俗名柳茶，為薔薇科灌木，主要生長(zhǎng)在海拔3 000～4 000米的陰坡灌木叢中或山谷砂石灘上[1]。其果穗和葉有健脾胃、治療消化不良及胃病等功效[2]，是藏族民間常用藥物[3]。藏區(qū)將窄葉鮮卑花作為茶用，無(wú)毒性報(bào)道[4]。現(xiàn)代藥理研究表明，窄葉鮮卑花具有抗氧化[5-6]、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、降脂減肥[7]、促消化[8]及提高機(jī)體特異性免疫[9]等功效。窄葉鮮卑花的果穗和葉中除含有有機(jī)酸類、三萜類、單萜、飽和脂肪醇類、多糖類、揮發(fā)油類及各種礦質(zhì)元素[5]外，還含有皂苷、多酚、黃酮等功能活性成分，這些活性成分對(duì)清除人體產(chǎn)生的自由基、延緩細(xì)胞衰老的速度、提高人體的免疫力、減緩病害的發(fā)生等具有重要的作用。本實(shí)驗(yàn)以窄葉鮮卑花為原料，對(duì)其果穗和葉的提取物多糖、多酚、黃酮和脂肪進(jìn)行了定量分析，同時(shí)研究了提取物在清除DPPH、ABTS自由基時(shí)，多糖、多酚、黃酮所起的抗氧化作用，以期為窄葉鮮卑花的開發(fā)及茶產(chǎn)品的研制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

窄葉鮮卑花，于2017年8月下旬采自山丹縣焉支山，采后自然陰干、研磨、低溫儲(chǔ)藏備用。綠茶由安徽省天旭茶業(yè)有限公司生產(chǎn)。鄰苯二氮菲、雙氧水、鹽酸、鄰苯三酚、FeSO4、乙醇、丙醛、甲醇、氯仿、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、沒(méi)食子酸、FeCl3、鐵氰化鉀均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

TGL-16C臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、DHG-9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海璽袁科學(xué)儀器有限公司）、BT125D分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、723PC可見(jiàn)光光度計(jì)（上海現(xiàn)科分光儀器有限公司）、RE-2000

A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市京華儀器有限責(zé)任公司）。

1.3方法

1.3.1窄葉鮮卑花測(cè)定液的制備

稱取研磨的窄葉鮮卑花果穗和葉各6.013 0 g、6.012 2 g，以料液比為1∶20在30 ℃、400 W超聲提取3次，將3次所得濾液合并，濃縮。以綠茶葉為對(duì)照，稱取6.036 2 g，制備方法同上。將上述3種濃縮液避光儲(chǔ)存，用于抗氧化的測(cè)定。

稱取果穗和葉各0.187 8 g、0.114 6 g，料液比為1∶40，葉用70%的乙醇，果穗用40%的乙醇，在40 ℃、400 W超聲波提取40 min，在2 800 r/min下離心8 min，取上清液，低溫、避光貯藏，用于多酚、黃酮的測(cè)定。

稱取果穗和葉各0.103 5 g、0.107 2 g，在相同條件下用水提取，離心，得上清液，取上清液1 mL，按體積比為1∶3加入3 mL 95%乙醇，沉淀過(guò)夜，收集沉淀，用水溶解，用于多糖的測(cè)定。

1.3.2窄葉鮮卑花總脂的提取

分別稱取果穗0.531 6 g、葉0.516 0 g，于具塞玻璃瓶中，分別加入甲醇-氯仿混合液（1∶1）40 mL，在40 ℃、400 W超聲波提取40 min，將提取液倒入坩堝中，35 ℃蒸干并稱重[10]。

1.3.3粗多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-濃硫酸法，以標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=1.684 9x+0.036 6，R2=0.979 2（y為吸光度值，x為質(zhì)量濃度mg/mL），測(cè)定多糖含量[11]。

1.3.4多酚含量的測(cè)定

采用福林-肖卡（Folin-Ciocalteu）比色法，以標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.013 9x+0.005 43，R2=

0.999 72（y為吸光度，x為質(zhì)量濃度μg/mL），測(cè)定多酚的含量[11]。

1.3.5黃酮含量的測(cè)定

以蘆丁作標(biāo)準(zhǔn)，用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法，以標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=1.172 1x-0.003 25，R2=0.994 7（y為吸光度值，x為質(zhì)量濃度mg/mL），測(cè)定黃酮的含量[11]。

1.3.6DPPH自由基清除率

在試管中加入1 mL提取物，再加入2 mL 0.003% DPPH溶液，振蕩后室溫下避光放置30 min，測(cè)定517 nm波長(zhǎng)的吸光度，以相應(yīng)體積的無(wú)水乙醇代替蒸餾水，用于測(cè)定窄葉鮮卑花總脂對(duì)DPPH自由基的清除作用。計(jì)算清除率[11]。

清除率（%）=（A0-AS+AC）/A0×100%。

式中：A0為1 mL水+2 mL DPPH溶液的吸光度；A

S為1 mL樣品溶液+2 mL的DPPH溶液的吸光度；A

C為1 mL待測(cè)溶液+2 mL 95%乙醇的吸光度（517 nm處樣品本身的吸光度），空白為蒸餾水。

1.3.7ABTS自由基清除率

在試管中加入1 mL窄葉鮮卑花提取物，再加入2 mL ABTS工作液振蕩后，避光靜置6 min，測(cè)定734 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，空白為無(wú)水乙醇，計(jì)算清除率。計(jì)算公式同上。

1.3.8還原力的測(cè)定

在試管中加入2 mL窄葉鮮卑花提取物，再加入2 mL磷酸緩沖液，混勻加2 mL鐵氰化鉀，50 ℃水浴20 min后，冷卻至室溫，加2 mL的三氯乙酸振蕩，然后取上清液2 mL，加入2 mL水，再加入0.4 mL FeCl3溶液，混勻反應(yīng)10 min，在波長(zhǎng)700 nm比色測(cè)定[11]。

清除率（%）=（A0-AS+AC）/A0 ×100%。

式中：A0為2 mL水+2 mL磷酸緩沖液+2 mL鐵氰化鉀+2 mL三氯乙酸+2 mL水+ 0.4 mL FeCl3；AS為2 mL樣液+2 mL磷酸緩沖液+2 mL鐵氰化鉀+2 mL三氯乙酸+2 mL水+0.4 mL FeCl3；Ac為2 mL樣液+2 mL磷酸緩沖液+2 mL水，空白為蒸餾水。

2結(jié)果與分析

2.1窄葉鮮卑花與提取物中多糖、多酚、黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)窄葉鮮卑花果穗和葉提取物中多糖、多酚、黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)見(jiàn)表1。

由表1測(cè)定結(jié)果可知，果穗和葉樣品中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對(duì)照組綠茶分別高33.65 mg/g和60.82 mg/g；果穗樣品中多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對(duì)照組綠茶低22.74 mg/g，而葉樣品中多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對(duì)照組綠茶高9.09 mg/g。果穗和葉樣品中黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對(duì)照組綠茶分別高70.26 mg/g和141.57 mg/g。果穗與葉比較，葉的多糖、多酚、黃酮均高于果穗，且葉中多糖、多酚和黃酮的提取率均高于果穗。

2.2窄葉鮮卑花中脂類物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

果穗中脂類質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.18 mg/g，葉中脂類質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.41 mg/g，葉中脂類高于果穗，原因可能是與葉中含有大量脂溶性色素物質(zhì)有關(guān)。

2.3提取物對(duì)自由基的清除率

2.3.1基于多糖質(zhì)量濃度的提取物對(duì)DPPH、ABTS自由基的清除能力

由圖1a）顯示，果穗和葉對(duì)DPPH自由基清除能力均表現(xiàn)為量效關(guān)系，且果穗的清除趨勢(shì)上升快，而葉的清除能力上升趨勢(shì)較平緩，而對(duì)照組綠茶呈先急升后平緩。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為0.49 mg/mL時(shí)，葉對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到84.2%，果穗清除率為83.5%。因此，多糖對(duì)果穗和葉中的DPPH自由基清除率較高。由圖1b）可知，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度小于0.05 mg/mL時(shí)，隨多糖質(zhì)量濃度的增大，系統(tǒng)內(nèi)清除ABTS自由基能力逐漸增強(qiáng)。在質(zhì)量濃度高于0.05 mg/mL后，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，果穗和綠茶清除能力趨勢(shì)平緩，而葉清除ABTS自由基能力緩慢上升，明顯高于果穗和綠茶。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到0.29 mg/mL時(shí)，葉清除率為98.36%，高于同質(zhì)量濃度下的果穗（95.86%）。

2.3.2基于多酚質(zhì)量濃度的提取物對(duì)DPPH、ABTS自由基的清除能力

由圖2a）可知，在多酚質(zhì)量濃度為0～0.3 mg/mL范圍內(nèi)，果穗、葉和綠茶清除DPPH自由基能力明顯呈上升趨勢(shì)。當(dāng)多酚質(zhì)量濃度為1.05 mg/mL時(shí)，葉和對(duì)照

組綠茶的清除率分別為84.96 %和85.16 %，均高于果穗。說(shuō)明多酚在葉和綠茶中清除DPPH自由基時(shí)起主要作用。由圖2b）可見(jiàn)，在多酚質(zhì)量濃度小于0.052 mg/mL范圍內(nèi)，3種反應(yīng)體系清除ABTS自由基能力較大。當(dāng)質(zhì)量濃度在0.105 mg/mL之后，隨著多酚質(zhì)量濃度的增加，果穗和葉清除ABTS自由基能力趨于平緩，綠茶清除率呈緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)，且多酚質(zhì)量濃度為0.65 mg/mL時(shí)，對(duì)照系統(tǒng)內(nèi)ABTS清除率高達(dá)98.94%，說(shuō)明多酚在綠茶清除ABTS自由基時(shí)起主要作用。而同質(zhì)量濃度下果穗和葉的清除率明顯弱于對(duì)照組綠茶。

2.3.3基于黃酮質(zhì)量濃度的提取物對(duì)DPPH、ABTS自由基的清除能力

由圖3a）可知，隨著黃酮質(zhì)量濃度的增大，反應(yīng)系統(tǒng)清除DPPH自由基能力的趨勢(shì)呈上升趨勢(shì)。當(dāng)黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到0.611 mg/mL時(shí)，葉的清除率達(dá)到85.57 %，果穗為83.93%，而對(duì)照組綠茶低于果穗和葉。由圖3b）可見(jiàn)，在黃酮質(zhì)量濃度小于0.031 mg/mL時(shí)，清除ABTS自由基趨勢(shì)變化較大，之后質(zhì)量濃度與清除率之間接近線性關(guān)系，但上升趨緩，且果穗和葉的清除率均高于對(duì)照。由此可知，在果穗、葉和綠茶提取物中，黃酮對(duì)清除DPPH、ABTS自由基都起主要作用。

2.3.4基于多糖、多酚、黃酮質(zhì)量濃度的提取物還原能力的測(cè)定

不同質(zhì)量濃度的多糖、多酚、黃酮液的還原能力測(cè)定見(jiàn)圖4。由圖4a）可見(jiàn)，隨著提取物多糖質(zhì)量濃度的增加，對(duì)照組綠茶線性更陡峭，而果穗和葉的趨勢(shì)較平緩，表明多糖在果穗和葉中的還原力能力變化不大。由圖4b）可知，多酚質(zhì)量濃度與反應(yīng)系統(tǒng)的還原能力呈量效齊升的線性關(guān)系，且對(duì)照組綠茶、果穗和葉的線性均陡峭，表明多酚在果穗、葉和綠茶中的還原力較強(qiáng)。由圖4c）可見(jiàn)，隨著黃酮質(zhì)量濃度的增加，果穗和葉的變化趨勢(shì)比較平緩，而對(duì)照組綠茶線性更陡峭。說(shuō)明黃酮在對(duì)照組綠茶中的還原能力比果穗和葉更強(qiáng)。

2.4窄葉鮮卑花脂類物質(zhì)清除DPPH、ABTS自由基的能力

由圖5a）可見(jiàn)，窄葉鮮卑花總脂對(duì)DPPH自由基有明顯的清除能力。當(dāng)果穗和葉脂類物質(zhì)質(zhì)量濃度在0.2 mg/mL之前時(shí)，其清除率增長(zhǎng)幅度較大，且果穗的清除率高于葉。當(dāng)果穗和葉脂類物質(zhì)質(zhì)量濃度大于0.3 mg/mL時(shí)，葉清除DPPH自由基的能力大于果穗，且隨著其質(zhì)量濃度增大，二者清除DPPH自由基能力趨于平緩。當(dāng)脂類質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL時(shí)，葉的清除率達(dá)到91.2%。由圖5 b）可知，在質(zhì)量濃度小于0.2 mg/mL范圍內(nèi)，脂類物質(zhì)對(duì)ABTS自由基的清除幅度較大，當(dāng)其質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí)，葉的清除率大于果穗。隨著脂類質(zhì)量濃度進(jìn)一步增大，果穗和葉的清除趨勢(shì)趨于平緩。當(dāng)脂類物質(zhì)質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL時(shí)，葉對(duì)ABTS自由基清除率達(dá)到最高（95.9%）。

3結(jié)束語(yǔ)

我國(guó)中草藥資源豐富，含有多種抗氧化成分如多糖、多酚、黃酮等[12]。本實(shí)驗(yàn)以窄葉鮮卑花為材料，對(duì)提取物中多糖、多酚和黃酮進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，果穗中多糖、多酚提取率分別為44.62%和39.14%，而葉中分別為52.3%和64.7%；果穗和葉黃酮提取率為20%左右。葉提取物中多糖、多酚和黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為37.52 mg/g、45.95 mg/g、47.35 mg/g，而果穗中分別為17.96 mg/g、17.71 mg/g和19.01 mg/g；果穗和葉中多糖、黃酮含量遠(yuǎn)高于對(duì)照組綠茶，而多酚含量卻明顯低于對(duì)照組綠茶。葉中脂類物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于果穗0.23 mg/g。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究表明，大多數(shù)自由基和活性氧與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系，尋找抗氧化劑和抗氧化機(jī)理的研究尤為重要[12]。本研究表明，果穗提取物中多糖對(duì)清除DPPH自由基以及葉提取物中多糖對(duì)清除ABTS自由基起主要作用，而綠茶提取物中多酚對(duì)清除DPPH、ABTS自由基起主要作用；果穗、葉和綠茶提取物中黃酮對(duì)清除DPPH、ABTS自由基均起作用。窄葉鮮卑花脂類物質(zhì)質(zhì)量濃度小于0.4 mg/mL時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的增大清除DPPH、ABTS自由基能力加大，當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.4 mg/mL時(shí)，脂類物質(zhì)對(duì)其清除趨勢(shì)逐漸平緩。結(jié)果顯示出果穗和葉具有良好的清除自由基和抗氧化能力。由此說(shuō)明，不同材料，不同部位、不同濃度，主要清除DPPH、ABTS自由基的抗氧化物質(zhì)不同，這與賈東升等在連翹上的研究和曾慧婷等在丹參上的研究一致。

窄葉鮮卑花果穗和葉中多酚的還原能力隨質(zhì)量濃度的增大而增大，多糖和黃酮在果穗和葉中的還原能力雖有增加，但二者增加幅度不大，而對(duì)照組綠茶中多糖、多酚和黃酮的還原能力均較大，說(shuō)明窄葉鮮卑花果穗和葉中具有還原能力的物質(zhì)主要是多酚。這可能是多酚含量與·OH清除活性和鐵離子還原能力具有較高的相關(guān)性[13]。

本研究采用體外抗氧化體系對(duì)抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)定，但與機(jī)體內(nèi)的抗氧化功效差異較大，因此，窄葉鮮卑花果穗和葉的藥效價(jià)值尚需要進(jìn)一步在以后實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證。

[參考文獻(xiàn)]

[1]吳寧.川西北窄葉鮮卑花灌叢的類型和生物量及其與環(huán)境因子的關(guān)系[J].植物學(xué)報(bào)，1998，40（9）：860-870.

[2]陶婷婷.窄葉鮮卑花的化學(xué)成分及質(zhì)量研究[D].成都：四川大學(xué)，2004.

[3]陶婷婷，瀨井康雄，王天志，等.窄葉鮮卑花的化學(xué)成分[J].中國(guó)天然藥物，2006，4（4）：257-259.

[4]趙媛，梁國(guó)興，王彩芳，等.窄葉鮮卑花化學(xué)成分研究（I）[J].北京師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，48（6）：621-625.

[5]謝勇輝，俞頌華，余銀芳，等.窄葉鮮卑花的化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].江西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，26（5）：97-100.

[6]劉昕，潘興斌，王蔭棠，等，柳茶對(duì)小鼠抗氧化能力及免疫器官影響的實(shí)驗(yàn)觀察[J].蘭州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1994，20（3）：143-145.

[7]劉昕，潘興斌，王蔭堂，等，柳茶提取物對(duì)正常小鼠血SOD、GSH-PX及MDA含量的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，1995，23（6）：35-36.

[8]姚莉，鞠洋.窄葉鮮卑花促消化作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2009，17（6）：376-378.

[9]潘興斌，劉昕，竇玉安.柳茶提取物對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能及對(duì)白細(xì)胞介素-2產(chǎn)生的影響[J].蘭州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1995，21（4）：201-204.

[10]王永華.食品分析[M].2版.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2014：94-95.

[11]于國(guó)萍.食品生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2012：130.

[12]賈東升，李榮喬，謝曉亮，等.連翹葉不同溶劑提取物體外抗氧化活性研究[J].食品研究與開發(fā)，2016，37（2）：14-18.

[13]曾慧婷， 宿樹蘭，沙秀秀，等.丹參莖葉提取物抗氧化活性物質(zhì)基礎(chǔ)與量效關(guān)系研究[J].中草藥，2017，48（22）：4688-4694.

（責(zé)任編輯李亞青）