油橄欖葉提取物對非酒精性脂肪肝小鼠TLR4—p38MAPK信號通路的干預作用

[摘要]探討油橄欖葉提取物干預非酒精性脂肪肝（NAFLD）的作用機制。用高脂飲食9周建立小鼠NAFLD模型，造模第2周起用OLE（1 000 mg/kg）進行灌胃治療8周，利用全自動生化分析儀測定血脂水平，放射免疫法檢測炎癥因子指標，定量PCR和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測肝組織中Toll樣受體蛋白4（TLR4）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）的水平和蛋白活力。結果顯示，與模型組比較，OLE干預后，血清甘油三酯（TG）、游離脂肪酸（FFA）濃度顯著降低；肝臟腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1（IL-1β）、TLR4、p38MAPK水平和蛋白顯著降低。OLE可通過調(diào)節(jié)TLR4-p38MAPK 信號通路，緩解肝臟脂肪變性和炎癥因子反應，抑制NAFLD的進展。

[關鍵詞]油橄欖葉提取物；非酒精性脂肪肝；信號通路；小鼠

[中圖分類號]R 282.710.5[文獻標志碼]A[文章編號]1005-0310（2018）03-0059-05

Abstract： The mechanism of olive leaf extract in the intervention of non-alcoholic fatty liver （NAFLD） is explored. The mouse NAFLD model is established with a high-fat diet for 9 weeks. The OLE （1 000 mg/kg） was used for intragastric administration for 8 weeks from the second week of establishment. The level of blood lipids was measured by an automatic biochemical analyzer， and the inflammatory index was measured by radioimmunoassay. Quantitative PCR and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） were used to detect Toll-like receptor protein 4 （TLR4） and p38 mitogen-activated protein kinase （p38MAPK） levels and protein activity in liver tissue. The results show that compared with the model group， serum triglyceride （TG） and free fatty acid （FFA） concentrations were significantly reduced after OLE intervention； liver tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1 （IL-1β）， TLR4， p38MAPK levels and protein were significantly reduced. OLE can alleviate hepatic steatosis and inflammatory factor responses and inhibit the progression of NAFLD by regulating the TLR4-p38MAPK signaling pathway.

Keywords： Olive leaf extract； Nonalcoholic fatty； Signaling pathway； Mouse

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是遺傳、環(huán)境、代謝應激相關性疾病，現(xiàn)已成為世界慢性肝病的重要病因，可直接導致失代償期肝硬化、肝細胞癌和移植肝復發(fā)等，但確切發(fā)病機制目前仍不清楚[1-2]。多酚、黃酮及橄欖苦苷是油橄欖葉主要活性成分，課題組前期已證實油橄欖葉提取物在排鉛、海洛因脫毒、預防糖尿病、抗衰老、減輕缺血再灌注損傷等方面表現(xiàn)出突出的效果[3-12]，具有調(diào)節(jié)肝臟抗氧化能力、改善非酒精性脂肪肝（NAFLD）小鼠肝功能的作用[13]。為進一步闡明其作用機制，本研究擬以小鼠為實驗對象，建立非酒精性脂肪肝動物模型，圍繞“Toll 樣受體蛋白4-p38 絲裂原活化蛋白激酶（TLR4-p38MAPK）”信號通路，觀察油橄欖葉提取物（olive leaf extract，OLE）對NAFLD的影響，以揭示OLE防治NAFLD的作用機制。

1材料與方法

1.1材料

油橄欖葉提取物（隴南田園油橄欖科技開發(fā)有限公司）；TNF-α、IL-1β試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；TLR4、p38MAPK ELISA試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）；RNA抽提試劑盒、反轉錄試劑、定量PCR試劑（Taka Ra公司），PCR引物由上海涵悅生物科技有限公司設計，生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

BS-300型全自動生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；酶聯(lián)免疫檢測儀（ELx800，美國BioTek公司）；高速臺式冷凍離心機（Beckman美國TGL-16 M）等；7900 HT Sequence Detection System定量PCR儀（美國ABI）；核酸蛋白分析儀（美國貝克曼庫爾特公司）。40只清潔級昆明小鼠購于蘭州大學實驗動物中心（許可證號：SCXK（甘）2009-0004），體質(zhì)量18～20 g，雌雄各半。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立與給藥

健康昆明小鼠40只，隨機分為4組，即正常組、模型組、羅格列酮組和OLE組，每組10只。參照文獻[14]，正常組普通飼料喂養(yǎng)，其他各組每天給高脂飼料（繁殖鼠料54.8%，18.9%豬油，1.3%膽固醇，0.3%膽鹽，11.2%蔗糖，8.7%酪蛋白，1.8%預混料及3%麥芽糊精）喂養(yǎng)9周，從造模第2周起正常組和模型組灌胃0.1 mL/（10 g·d）生理鹽水，OLE組灌胃OLE（1 000 mg/（kg·d））進行治療，連續(xù)給藥8周。

1.2.2血生化指標測定

各組實驗動物均用乙醚麻醉，摘眼球采血以3 000 r/min離心10 min，分離血清，用全自動生化分析儀檢測TG和FFA濃度。

1.2.3肝組織中TNF-α、IL-1β含量的檢測

末次給藥后，迅速取肝，洗凈、冰浴勻漿，3 000 r/min離心15 min，取上清液，采用放射免疫法中的液相競爭法和平衡法測定肝組織中TNF-α、IL-1β的含量，具體方法按照檢測試劑盒說明書操作。

1.2.4肝組織中TLR4、p38MAPK蛋白活力的測定

取100 mg濕肝，加入1 mL PBS緩沖液，冰浴中勻漿（10 000 r/min）20 s，重復2次，將勻漿液4 ℃（3 600 r/min）離心20 min，取上清液，ELISA試劑盒檢測。

1.2.5PCR檢測肝組織中TLR4、p38MAPK mRNA 的表達

取小鼠肝臟，放入2 mL 的離心管，加入1 mL Trizol后用勻漿器反復研磨，離心（14 000 r/min）10 min，取上清液通過酚-氯仿抽提RNA，將抽提的RNA 進行逆轉錄反應，實時熒光PCR擴增。PCR按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.6數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)以±s表示，用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1OLE對NAFLD小鼠血清中TG、FFA濃度的影響

由圖1可知，模型組小鼠的血清TG、FFA濃度較正常組均顯著升高（P<0.01）；OLE組和羅格列酮組小鼠血清TG、FFA 濃度較模型組顯著降低（P<0.01）；OLE組小鼠血清TG、FFA濃度顯著低于羅格列酮組（P<0.05，P<0.01）。

2.2OLE對NAFLD小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β質(zhì)量濃度的影響

由圖2可知，模型組小鼠的肝組織中TNF-α、IL-1β的質(zhì)量濃度較正常組均顯著升高（P<0.01）；OLE組和羅格列酮組小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β的質(zhì)量濃度較模型組顯著降低（P<0.01）；OLE組小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β的質(zhì)量濃度顯著低于羅格列酮組（P<0.05，P<0.01）。

2.3OLE對NAFLD 小鼠肝組織中p38MAPK mRNA表達的影響

由圖3可知，模型組小鼠肝組織中TLR4、p38MAPK mRNA的表達量較正常組顯著升高（P<0.01）；OLE組和羅格列酮組小鼠肝組織中TLR4、p38MAPK mRNA的表達量較模型組顯著降低（P<0.01）；OLE組小鼠肝組織中TLR4、p38MAPK mRNA的表達量顯著低于羅格列酮組（P<0.05，P<0.01）。

2.4OLE對NAFLD 小鼠肝組織中TLR4、p38MAPK 蛋白活力的影響

由圖4可知，模型組小鼠肝組織中TLR4、p38MAPK的蛋白活力較正常組顯著升高（P<0.01）；OLE組和羅格列酮組小鼠肝組織中TLR4、p38MAPK的蛋白活力較模型組顯著降低（P<0.01）；OLE組小鼠肝組織中TLR4、p38MAPK 的蛋白活力顯著低于羅格列酮組（P<0.01）。

3討論

中藥具有活性成分多、作用靶點多、給藥途徑多、不良反應小等特點，顯示出良好的臨床療效和安全性。油橄欖葉主要活性成分是多酚、黃酮及橄欖苦苷，既往已證實油橄欖葉提取物具有良好的防治NAFLD的藥效學效應[13]。TG、FFA含量是國內(nèi)外應用較為廣泛的衡量肝功能的重要指標，也是反映脂肪肝的重要指標[15]。本研究結果表明，OLE對模型組小鼠顯著升高的TG、FFA含量具有高強度的抑制效應。

NAFLD 發(fā)病涉及TLR4-P38MAPK 信號通路異常[16]，TLR4-P38MAPK通路是介導炎癥發(fā)生的主要信號轉導通路之一[17]。TLR4是 p38MAPK 上游分子，屬于toll樣受體家族成員，是介導天然免疫和獲得性免疫的跨膜蛋白，可通過識別相關配體活化信號通路中的下游轉錄因子，調(diào)控下游蛋白激酶，促使效應細胞表達、合成并釋放大量的炎癥因子，從而引發(fā)肝損傷[18-19]。本實驗結果顯示，模型組小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β的質(zhì)量濃度，TLR4、P38MAPK的基因表達水平及蛋白活力均明顯升高，經(jīng)OLE干預后，肝組織中TNF-α、IL-1β質(zhì)量濃度，TLR4、P38MAPK的表達水平均呈下降趨勢，表明OLE 對其有下調(diào)作用。研究表明，阻斷TLR4-p38MAPK信號通路能減輕炎癥反應，提示TLR4-p38MAPK 信號通路可能是OLE發(fā)揮抗炎和改善脂質(zhì)代謝紊亂作用靶點。

綜上所述，OLE可通過調(diào)節(jié)TLR4-p38MAPK 信號通路，緩解肝臟脂肪變性和炎癥因子反應，抑制NAFLD的進展。該實驗為研發(fā)OLE制劑防治肝損傷相關疾病提供了理論與實驗依據(jù)，但有關其藥理作用機制和量效關系等尚需進一步研究。

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（責任編輯李亞青）