UPLC—Q—TOF—MS法分析苗藥黑骨藤提取物中的化學(xué)成分

覃小麗 陳浩 李奎 黃勇 鞏仔鵬 李月婷 李勇軍 鄭林

摘 要 目的：建立黑骨藤提取物中化學(xué)成分的分析方法，為進(jìn)一步闡明黑骨藤藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。方法：以70%乙醇為溶劑制備黑骨藤提取物。采用超高效液相色譜-四級桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-Q-TOF-MS）對提取物進(jìn)行成分分析，色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18，流動(dòng)相為0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈（梯度洗脫），流速為0.25 mL/min；采用電噴霧離子源，在負(fù)離子掃描模式下檢測。通過碎片離子信息、相關(guān)文獻(xiàn)以及對照品比對，確定黑骨藤提取物中的化學(xué)成分。結(jié)果：在黑骨藤提取物中共分離出了23個(gè)化合物，并確定了9個(gè)化合物。其中，5、8、9、16、17、18、22、23號峰通過與對照品比對分別確定為5-O-咖啡?；鼘幩?、3-O-咖啡?；鼘幩?、4-O-咖啡?；鼘幩帷?，4-O-二咖啡酰基奎寧酸、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸、4，5-O-二咖啡酰基奎寧酸、杠柳毒苷、杠柳苷元；13號峰通過碎片離子和文獻(xiàn)比對推斷為（1S，3R，4R，5R）-3-{[（2E）-3-（3，4-dihydroxyphenyl）-2-propenoyl]oxy}-1，5-dihydroxy-4-{[（2E）-3-（4-hydroxy-3，5-dimethoxyphenyl）-2-propenoyl]oxy}cyclohexanecarboxylic acid。結(jié)論：建立的UPLC-Q-TOF- MS法可以快速、高效、準(zhǔn)確地分析黑骨藤提取物中的化學(xué)成分。

關(guān)鍵詞 苗藥；黑骨藤；超高效液相色譜-四級桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)；化學(xué)成分

中圖分類號 R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）21-2949-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.21.16

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the analysis of chemical compositions in Periploca forrestii extract， and to provide reference for further elucidating the chemical basis of the P. forrestii. METHODS： 70% ethanol was used to prepare P. forrestii extract. UPLC-Q-TOF-MS was adopted to analyze the chemical compositions of the extract. The determination was performed on an Agilent Eclipse Plus C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid water-0.1% formic acid acetonitrile （gradient eludtion） at the flow rate of 0.25 mL/min. ESI source was applied to analyze the chemical composition of P. forrestii extract in negative scanning ion mode. The chemical constituents of P. forrestii extract were confirmed by the fragment ion information， related literature and standard control comparison. RESULTS： Totally 23 compounds were separated from P. forrestii extract， and 9 compounds were indentified. The peaks of 5， 8， 9， 16， 17， 18， 22 and 23 were identified as 5-O-caffeoylquinic acid， 3-O-caffeoylquinic acid， 4-O-caffeoylquinic acid， 3，4-O-dicaffeoylquinic acid， 3，5-O-dicaffeoylquinic acid， 4，5-O- dicaffeoylquinic acid， glucoperiplocymarin and periplogenin by comparison with standard control. The peak of 13 was deduced as （1S，3R，4R，5R）-3-{[（2E）-3-（3，4-dihydroxyphenyl）-2-propenoyl]oxy}-1，5-dihydroxy-4-{[（2E）-3-（4-hydroxy-3，5-dimethoxyphenyl）- 2-propenoyl]oxy}cyclohexanecarboxylic acid by comparison with fragment ion information and related literature. CONCLUSIONS： The established UPLC-Q-TOF-MS method can be used for the rapid， efficient and accurate analysis of the chemical constituents in P. forrestii extract.

KEYWORDS Miao medicine； Periploca forrestii； UPLC- Q-TOF-MS； Chemical composition

黑骨藤為蘿藦科杠柳屬植物黑龍骨（Periploca forrestii Schltr.）的干燥根或全株，收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003年版）中[1]，是貴苗族常用藥，具有通經(jīng)、活血和祛風(fēng)等功效，并且對風(fēng)濕、類風(fēng)濕疾病所引起的軟組織無菌性炎癥亦有較強(qiáng)的消腫止痛作用[2-3]。黑骨藤植物中含有多種化學(xué)成分，主要是強(qiáng)心苷類、C21甾類、三萜類、蒽醌類、黃酮類、苯丙素類等[4-6]。本課題組前期對黑骨藤化學(xué)成分進(jìn)行了研究，首次從中分離鑒定出了3-O-咖啡酰基奎寧酸、4-O-咖啡?；鼘幩帷?-O-咖啡?；鼘幩岬瓤Х弱；鼘幩犷惢衔颷7]以及杠柳苷元、滇杠柳苷元A等強(qiáng)心苷類化合物[7-8]。但多局限在單一成分的分離及單一成分質(zhì)譜鑒定方面，尚未建立一種快速分析黑骨藤中多種成分的液質(zhì)聯(lián)用方法。

近年來，超高效液相色譜-四級桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-Q-TOF-MS）已在中藥研究方面廣泛應(yīng)用，可在缺少對照品的情況下對成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，具有高效、快速且靈敏度高的特點(diǎn)。因此，本研究擬采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對黑骨藤提取物中化學(xué)成分同時(shí)進(jìn)行快速分析，根據(jù)色譜峰在質(zhì)譜中的精確相對分子質(zhì)量、碎片離子信息、質(zhì)譜裂解規(guī)律和色譜保留規(guī)律，并結(jié)合對照品的質(zhì)譜信息和參考文獻(xiàn)，鑒定化合物結(jié)構(gòu)，為黑骨藤成分鑒定提供一種快速、簡便、可靠的手段，進(jìn)而為黑骨藤藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量評價(jià)、藥動(dòng)學(xué)及作用機(jī)制方面的研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UPLC-Q-TOF-MS系統(tǒng)（包括二元泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、色譜柱恒溫箱、Bruker MicroTOF-Q Ⅱ高分辨質(zhì)譜儀等）購自美國安捷倫公司；Allegra 64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特公司）；EI204萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；超純水機(jī)（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）。

1.2 藥品與試劑

黑骨藤藥材購于貴州貴陽市萬東橋中藥材市場（批號：20170910），經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室龍慶德副教授鑒定為蘿藦科杠柳屬植物黑龍骨（Periploca forrestii Schltr.）的干燥根和莖；杠柳毒苷、3-O-咖啡酰基奎寧酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111793-200901、110753-201415，純度：均≥98%）；5-O-咖啡?；鼘幩?、4-O-咖啡?；鼘幩?、3，4-O-二咖啡?；鼘幩帷?，5-O-二咖啡?；鼘幩?、4，5-O-二咖啡酰基奎寧酸對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號：AB7050442、AB7061002、wkq17060705、wkq17092212、wkq17120111，純度：均≥98%）；杠柳苷元對照品（貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制，批號：20160511，純度：≥98%）；甲醇、乙腈為色譜純，水為蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B）（梯度洗脫程序見表1）；流速：0.25 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：1 ?L。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI），掃描方式：負(fù)離子模式，掃描范圍：質(zhì)荷比（m/z）100～1 000；毛細(xì)管電壓：4.5 kV；錐孔電壓：150 V；離子源溫度：110 ℃；霧化氣：N2，霧化壓力：0.12 MPa，霧化氣溫度：200 ℃；干燥氣流速：8.0 mL/min；準(zhǔn)確質(zhì)量測定采用甲酸鈉校正標(biāo)準(zhǔn)液；采用Data Analysis、Metabolite Detect軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別精密稱取3-O-咖啡?；鼘幩?、5-O-咖啡酰基奎寧酸、4-O-咖啡?；鼘幩帷?，4-O-二咖啡酰基奎寧酸、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸、4，5-O-二咖啡?；鼘幩?、杠柳毒苷、杠柳苷元對照品適量，置于不同10 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，分別得到3-O-咖啡?；鼘幩幔?.110 g/L）、5-O-咖啡?；鼘幩幔?.032 g/L）、4-O-咖啡酰基奎寧酸（1.026 g/L）、3，4-O-二咖啡?；鼘幩幔?.032 g/L）、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸（1.038 g/L）、4，5-O-二咖啡?；鼘幩幔?.204 g/L）、杠柳毒苷（1.058 g/L）、杠柳苷元（0.515 g/L）的單一標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于 -20 ℃冰箱中保存，備用。

2.4 黑骨藤提取物的制備

稱取黑骨藤藥材120 g，70%乙醇浸泡30 min，加10倍量70%乙醇提取3次，提取時(shí)間分別為1.5、1、1 h，過濾，合并3次濾液，濃縮溶液，45 ℃真空干燥，得黑骨藤提取物，干燥器中保存，備用。稱取黑骨藤提取物約1.0 g，置于25 mL量瓶中，加入20 mL的50%甲醇溶液溶解，超聲（頻率40 kHz，功率300 W）10 min，搖勻，用50%甲醇溶液定容至25 mL，然后于冷凍高速離心機(jī)中以 12 000 r/min離心10 min，收集上清液，即得。

2.5 化學(xué)成分的分析

取“2.4”項(xiàng)下黑骨藤提取物和“2.3”項(xiàng)下各標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣分析，采用Data Analysis軟件分析各成分峰的碎片離子信息，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[7，9]以及標(biāo)準(zhǔn)品對照進(jìn)行化學(xué)成分確認(rèn)。黑骨藤提取物的總離子流圖見圖1，黑骨藤提取物中鑒定成分與對照品的質(zhì)譜圖見圖2、化學(xué)成分信息見表2。

由圖1顯示，從黑骨藤提取物中共分離出了23個(gè)化合物。通過與對照品的保留時(shí)間和質(zhì)譜圖比對，確定5、8、9、16、17、18、22、23號峰分別為5-O-咖啡?；鼘幩?、3-O-咖啡?；鼘幩帷?-O-咖啡酰基奎寧酸、3，4-O-二咖啡?；鼘幩帷?，5-O-二咖啡?；鼘幩?、4，5-O-二咖啡酰基奎寧酸、杠柳毒苷和杠柳苷元。13號峰的保留時(shí)間為9.1 min，用Data Analysis軟件對該化合物進(jìn)行預(yù)測，在負(fù)離子模式下得到準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]- m/z 559.147 6（score 100，誤差[ppm]-3.4），失去1分子芥子酸得到碎片離子為[M-C11H12O5+H2O-H]- m/z 353，再結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[10]，推測其為（1S，3R，4R，5R）-3-{[（2E）-3-（3，4-dihydroxyphenyl）-2-propenoyl]oxy}-1，5-dihydroxy-4- {[（2E）-3-（4-hydroxy-3，5-dimethoxyphenyl）-2-propenoyl]oxy}cyclohexanecarboxylic acid。

3 討論

中藥體系的分析一直是分析領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，也是中藥現(xiàn)代化的瓶頸之一，而中藥藥物化學(xué)成分的分析和驗(yàn)證是整個(gè)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的重要環(huán)節(jié)和基礎(chǔ)[11]。UPLC-Q-TOF-MS與其他方法相比，由于其離子傳輸效率高、重現(xiàn)性高、靈敏度高、錯(cuò)誤率低等優(yōu)點(diǎn)，在復(fù)雜中藥體系的分析中具有明顯優(yōu)勢[12]。在前期研究中，筆者對色譜條件進(jìn)行了篩選，先分別以甲醇-水、乙腈-水等流動(dòng)相體系進(jìn)行液質(zhì)分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑骨藤提取物中化學(xué)成分的分離效果不理想。隨后，筆者考慮在流動(dòng)相中入適當(dāng)?shù)乃峋S持樣品在流動(dòng)相中的電離狀態(tài)，從而有助于樣品中物質(zhì)的分離，而甲酸易于揮發(fā)且一般色譜柱在酸性流動(dòng)相中較耐受，所以選用0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇、0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈等流動(dòng)相體系進(jìn)行分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈的流動(dòng)相后基線更加平穩(wěn)、峰形更加尖銳、分離度也較好，且這些化學(xué)成分的出峰時(shí)間均較短。

在提取物的制備上，筆者通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[7]，綜合考慮選用水和30%、50%、70%、95%乙醇等溶劑進(jìn)行黑骨藤藥材提取，為了使藥材中的有效成分充分地被檢測出，為黑骨藤的質(zhì)量控制和藥動(dòng)學(xué)等研究提供參考，因此以色譜圖中峰的信息量、藥材中各色譜峰的單位質(zhì)量峰面積最大化原則，選擇提取率相對較高的提取溶劑。結(jié)果表明，采用70%、95%乙醇為溶劑時(shí)，所得色譜圖中的峰數(shù)和豐度均優(yōu)于以水、30%乙醇、50%乙醇為溶劑時(shí)的結(jié)果，而以70%、95%乙醇為提取溶劑時(shí)，色譜圖無明顯差異，但95%乙醇濃度更高，從經(jīng)濟(jì)和實(shí)驗(yàn)安全性等方面綜合考慮，最終選用70%乙醇為黑骨藤的提取溶劑。

本研究從黑骨藤提取物中分離出了23個(gè)化合物，共鑒定出了8個(gè)化合物，多數(shù)為單咖啡?；鼘幩犷惡投Х弱；鼘幩犷惖然瘜W(xué)成分，這些成分具有明顯的抗菌、抗病毒、抗炎、清除自由基、降血糖、降血脂等作用[13]。本課題組前期對黑骨藤提取物的藥效進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)其中的咖啡?；鼘幩犷惢衔锞哂锌诡愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的活性[14]。由此可見，鑒定出的化合物可能是黑骨藤治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥效物質(zhì)，但對黑骨藤的化學(xué)成分及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)有待進(jìn)一步和更深層次的研究。

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（收稿日期：2018-04-23 修回日期：2018-08-31）

（編輯：林 靜）