響應(yīng)面優(yōu)化a—細(xì)辛腦前體脂質(zhì)體的制備及體外釋放度研究

馮學(xué)珍 韋啓球 李曼麗 何世潔 羅富娣

摘要：利用載體沉積法制備a-細(xì)辛腦前體脂質(zhì)體，以包封率為考察指標(biāo)，采用Box-Behnken Design-響應(yīng)面優(yōu)化法（BBD-RSM）優(yōu)化最佳制備工藝；以滲漏率為指標(biāo)分別考察a-細(xì)辛腦前體脂質(zhì)體的固體粉末和溶液在4℃和室溫6個月內(nèi)的穩(wěn)定性.優(yōu)化后的最佳工藝為：卵磷脂用量1.90 g，卵磷脂與膽固醇的重比為6.63：1，卵磷脂與a-細(xì)辛腦重比為27.08：1，藥物的包封率為93.36%.a-細(xì)辛腦前體脂質(zhì)體固體粉末4℃和25℃放置都較穩(wěn)定，其體外釋放規(guī)律符合Hignchi方程.該優(yōu)化工藝穩(wěn)定可靠，a-細(xì)辛腦前體脂質(zhì)體固體粉末可在室溫條件下貯存，其在體外具有良好的緩釋作用。

關(guān)鍵詞：a-細(xì)辛腦；前體脂質(zhì)體；響應(yīng)面優(yōu)化；穩(wěn)定性；體外釋放

0引言

a-細(xì)辛腦（asarone），即（2，4，5-三甲氧基-1-丙烯基苯）是天南星科植物石菖蒲的主要有效成分之一，又名a-細(xì)辛醚，可用于止咳、化痰、平喘，對肺炎、慢性氣管炎均有較好的療效，a-細(xì)辛腦熔點(diǎn)低、脂溶性強(qiáng)，制成生物利用度高的口服固體制劑有一定困難。

脂質(zhì)體是臨床應(yīng)用較多的藥物靶向傳遞系統(tǒng)之一，但普通脂質(zhì)體大多數(shù)情況下以混懸液的形式存在，長時間存放不穩(wěn)定，易發(fā)生分層、凝聚、沉降、分解、藥物滲漏等情況前體脂質(zhì)體（prolipo-somes）是將脂質(zhì)體膜材和藥物的混合液在減壓攪拌下逐步分布到一種可溶性固體載體表面，從而形成自由流動的粉體狀制劑即為前體脂質(zhì)體，可解決普通脂質(zhì)體存在的凝聚、滲漏等問題.國內(nèi)外學(xué)者對前體脂質(zhì)體的制備和質(zhì)量評價都進(jìn)行了深入研究，除本課題組前期制備的a-細(xì)辛腦前體脂質(zhì)體之外，目前鮮見其他關(guān)于a-細(xì)辛腦前體脂質(zhì)體的報道.本文在課題組前期制備的基礎(chǔ)上，采取Box-Behnken Design-響應(yīng)面優(yōu)化法（BBD-RSM），優(yōu)化了a-細(xì)辛腦前體脂質(zhì)體的制備工藝，考察了前體脂質(zhì)體的穩(wěn)定性及體外釋放度，為把a(bǔ)-細(xì)辛腦前體脂質(zhì)體開發(fā)成新藥打下良好的基礎(chǔ)。

1材料與儀器

1.1藥品與試劑

a-細(xì)辛腦（廣西億康藥業(yè)，批號080626，含量98.6%）；膽固醇（AR，國藥集團(tuán)試劑公司）；卵磷脂（AR，德國利寶益）；甘露醇（AR，國藥集團(tuán)試劑公司）；甲醇（色譜純，國藥集團(tuán)試劑公司）；維生素E（AR，國藥集團(tuán)試劑公司）；其他試劑均為分析純.

1.2儀器

Agilent-1260型高效液相色譜儀（Agilent）；Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18液相色譜柱（150 mmx4.6mm，5 μm）（Agilent）；Millipore超純水儀Direct-Q3 UV（默克化工技術(shù)有限公司）；EYELA N-1300v-WB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（島津公司）；Microcon YM-50離心超濾管（50KDa，0.5 mL，美國Milipore）；智能溶出度測試儀RC-3（天津市新天光分析儀器技術(shù)有限公司）等。

2方法與結(jié)果

2.1a-細(xì)辛腦前體脂質(zhì)體的制備工藝

在本課題組前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，甘露醇載體沉積法制備a-細(xì)辛腦前體脂質(zhì)體.稱取處方量的a-細(xì)辛腦、膽固醇、卵磷脂溶于無水乙醇中，稱取少量維生素E溶解于上述無水乙醇中（維生素E與卵磷脂重比為1：50），超聲分散獲得類脂質(zhì)澄明溶液.然后稱取處方量的甘露醇粉末加入上述類脂質(zhì)溶液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干，干燥即得a-細(xì)辛腦前體脂質(zhì)體。

2.2a-細(xì)辛腦含量的測定

色譜條件：色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（150 mmX4.6 mm，5 um）；流動相：甲醇一水（65：35，V/V）；流速1.0mL/min；檢測波長：313 nm；進(jìn)樣量：20μL；柱溫30℃。

a-細(xì)辛腦在20～100μg/mL范圍內(nèi)與峰面積Y呈良好的線性關(guān)系，回歸方程Y=41.49x+16.38（r=0.990 3）；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，relative standarddeviation）為0.44%（n=5）；低、中和高3種劑量平均回收率分別為99.05%、101.20%和101.50%，RSD分別為1.44%、0.69%和0.80%（n=3），符合試驗(yàn)測定要求。

2.3脂質(zhì)體包封率的測定

稱取a-細(xì)辛腦前體脂質(zhì)體固體粉末溶解在生理鹽水中得一定濃度的a-細(xì)辛腦前體脂質(zhì)體混懸液，經(jīng)破乳、過膜、離心后可得細(xì)辛腦前體脂質(zhì)體離心液和混懸液，加甲醇溶解定容.精密量取20μL注入高效液相色譜儀，計算藥物總濃度及離心液中游離藥物濃度，根據(jù)下式計算藥物包封率（E）。

2.4 BBD-RSM優(yōu)化a-細(xì)辛腦前體脂質(zhì)體試驗(yàn)

在本課題組前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選3個對包封率影響較大的因素為自變量：卵磷脂用量（A）、卵磷脂與膽固醇重比（B）、卵磷脂與a-細(xì)辛腦重比（C），采用Dseign-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計，以包封率（E）為響應(yīng)值，共設(shè)計了17組試驗(yàn)，因素水平見表1，測定結(jié)果見表2。

2.5響應(yīng)面法優(yōu)化a-細(xì)辛腦的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及模型擬合

采用Dseign-Expert 8.0.6.1對表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，模型的方差分析表見表3，得二次多項式回歸方程Y=92.39+3.21A+1.72B+2.30C+1.14AB-1.64AC-1.69BC-4.06A²-4.65B²-4.75C²（R²=0.976 7，P<0.0001，F(xiàn)=32.56，失擬度檢驗(yàn)p=0.093 6>0.05，F(xiàn)=4.38）。

由表3可知試驗(yàn)設(shè)計所選擇的3個因素（A、B、C）對a-細(xì)辛腦包封率均有顯著的影響，其中AC、BC對a-細(xì)辛腦包封率也有顯著的影響.模型F值較高（32.56），P<0.000 1，說明擬合模型高度顯著；失擬項F值較小（4.38），P>0.05，失擬項不顯著，該模型的信噪比高（16.608），方程的決定系數(shù)R²=0.9767>0.95，表明實(shí)測值與預(yù)測值之間有高度的相關(guān)性；其校正決定系數(shù)R²為0.9467，表明模型響應(yīng)值的變化有94.67%來源于所選自變量，說明模型在回歸區(qū)域擬合良好，符合實(shí)驗(yàn)要求，可用該回歸模型對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2.6參數(shù)優(yōu)化及模型預(yù)測

為確定a-細(xì)辛腦的最佳制備優(yōu)化工藝，構(gòu)建了三維曲面圖，圖1-圖3顯示了影響a-細(xì)辛腦包封率的自變量及交互影響.

圖1示出了在固定的卵磷脂與膽固醇重比（B）條件下，a-細(xì)辛腦包封率在卵磷脂用量（A）及卵磷脂與a一細(xì)辛腦重比（C）的交互影響.隨著A和C的增加，響應(yīng)值a-細(xì)辛腦包封率均先升后降，3D圖為一曲面.在卵磷脂用量（A）為1.90 g時a-細(xì)辛腦包封率最高，分析可能的原因?yàn)椋弘S著卵磷脂量的增加，磷脂所形成的脂質(zhì)雙分子層包裹的藥物增加，從而包封率增加，但卵磷脂量繼續(xù)增加，雙分子膜的通透性和不對稱性也會增大，可能導(dǎo)致藥物滲漏增多從而包封率下降。

圖2示出了在固定的卵磷脂用量（A）條件下，a-細(xì)辛腦包封率在卵磷脂與膽固醇重比（B）及卵磷脂與a-細(xì)辛腦重比（C）的交互影響.隨著B和C的增加，響應(yīng)值a-細(xì)辛腦包封率均先升后降，3D圖為一曲面.在卵磷脂與膽固醇重比（B）為6.63：1時，a-細(xì)辛腦包封率最高，過低的膽固醇濃度會影響脂質(zhì)體成膜，膽固醇量增加，膜中雙分子排列的緊密程度也增加，從而起到穩(wěn)定雙分子膜的作用，但是膽固醇量繼續(xù)增加可能會使脂質(zhì)體膜的剛性也增加，總表面積減少，所包裹的藥物量減少，從而包封率降低，膽固醇量的增加也會影響脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。

圖3示出了在固定的卵磷脂與a-細(xì)辛腦重比（C）條件下，a-細(xì)辛腦包封率在卵磷脂用量（A）及卵磷脂與膽固醇重比（B）的交互影響.隨著A和B的增加，響應(yīng)值a-細(xì)辛腦包封率均先升后降，3D圖為一曲面。由圖1-圖3可以看出，圖1一圖2的3D圖坡度比圖3陡，這說明AC、BC交互作用對a-細(xì)辛腦包封率的影響比AB大，這與表3方差分析的結(jié)果一致。

軟件預(yù)測的最佳卵磷脂質(zhì)量1.90g，卵磷脂與膽固醇重比6.63：1，卵磷脂與a-細(xì)辛腦重比為27.08：1.該軟件預(yù)測的優(yōu)化包封率為93.36%.根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)情況，在卵磷脂質(zhì)量1.90g，卵磷脂與膽固醇重比6.6：1，卵磷脂與a-細(xì)辛腦重比為27.1：1的條件下進(jìn)行模型的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：a-細(xì)辛腦平均包封率為94.53%.該結(jié)果表明：該優(yōu)化工藝穩(wěn)定可靠，實(shí)驗(yàn)值與建立的模型預(yù)測值基本一致。

2.7脂質(zhì)體穩(wěn)定性的考察

將制備的a-細(xì)辛腦前體脂質(zhì)體固體粉末1g置于封口袋中，a-細(xì)辛腦前體脂質(zhì)體固體粉末1g溶解后置于具塞試管中，每組設(shè)3個平行，將其分別放在層析柜（4℃）和室溫（25℃）保存6個月，分別在1、2、3、4、5、6個月時取樣進(jìn)行滲漏率和包封率的測定.包封率的測定按照式（1）進(jìn)行，滲漏率的測定按照式（2），穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

式中，E為未放置之前的藥物的包封率，E為放置一段時間之后的包封率.

由表1的結(jié)果可知，a-細(xì)辛腦前體脂質(zhì)體固體粉末4℃下放置6個月比較穩(wěn)定，25℃放置6個月之后的滲漏率仍在10%之內(nèi).而25℃下a-細(xì)辛腦前體脂質(zhì)體溶液滲漏率到第3個月已經(jīng)達(dá)到20.74%，之后脂質(zhì)體水溶液開始出現(xiàn)絮狀沉淀，隨著時間的延長絮狀沉淀開始發(fā)黑，說明脂質(zhì)體已經(jīng)發(fā)生霉變和絮凝，而在4℃條件下無論脂質(zhì)體的粉末還是水溶液都沒有出現(xiàn)霉變和絮凝的狀態(tài).結(jié)果表明：a-細(xì)辛腦前體脂質(zhì)體固體粉末4℃和25℃放置都較穩(wěn)定。

2.8體外釋放度的考察

取3批a-細(xì)辛腦前體脂質(zhì)體的固體粉末溶解在生理鹽水中，參照中國藥典2015版溶出度的測定法——轉(zhuǎn)籃法，以人工胃液（900 mL）為溶出介質(zhì)，37℃下恒溫振搖，100 r/min轉(zhuǎn)速下每間隔1 h取樣（同時補(bǔ)足等量人工胃液）、稀釋、過膜注入高效液相色譜儀，進(jìn)行a-細(xì)辛腦含量的測定，計算累計釋放率（3批樣品平均值）.以時間為橫坐標(biāo)，樣品各時間點(diǎn)的累積釋放率為縱坐標(biāo)繪制曲線，如圖4所示.由圖可知，在0-12h內(nèi)藥物釋放速度相對緩慢，12 h累積釋藥量90.21%.說明自制的a-細(xì)辛腦前體脂質(zhì)體具有一定的緩釋作用，能夠?yàn)榕R床提供相對平穩(wěn)的血藥濃度，減少副作用的發(fā)生及給藥次數(shù).

將a-細(xì)辛腦的累積釋放度（M/M）或待釋放度（1-M/M）與時間（t）分別按零級方程、一級方程和Higuchi方程進(jìn)行擬合，其零級擬合方程：M/M=0.066 5 t+0.233 1，r²=0.884 1；一級擬合方程：ln（1 M/M）=-0.1988 t-0.074 6，r²=0.950 4；Higuehi擬合方程：M/M=0.272 3 t+0.019 6，r²=0.992 1.結(jié)果表明Higuchi方程擬合的相關(guān)系數(shù)最大，R²>0.99，因此采用Higuchi擬合的方程相關(guān)性最好。

3結(jié)論

前體脂質(zhì)體是指將脂質(zhì)材料吸附于載體上制備成的粉末狀制劑，可提高制劑的穩(wěn)定性，避免了用傳統(tǒng)方法制備脂質(zhì)體所存在的問題本研究采用載體沉積法制備a-細(xì)辛腦前體脂質(zhì)體，以卵磷脂、膽固醇為膜材，甘露醇為載體，以包封率作為評價指標(biāo)，采用Box-Behnken Design-響應(yīng)面法對工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的最佳工藝條件：卵磷脂質(zhì)量1.90g，卵磷脂與膽固醇重比6.63：1，卵磷脂與a-細(xì)辛腦重比為27.08：1.a-細(xì)辛腦前體脂質(zhì)體固體粉末4℃和25℃放置都較穩(wěn)定，其體外釋放規(guī)律符合Higuchi方程.該優(yōu)化工藝穩(wěn)定可靠，a-細(xì)辛腦前體脂質(zhì)體固體粉末可在室溫條件下貯存，其在體外具有良好的緩釋作用。