三七總皂甙對高脂飲食糖尿病大鼠炎癥因子和主動脈脂質代謝的影響

鄭建雷 李忠杰 孫渴望 王海清

冠狀動脈粥樣硬化是多因素作用的慢性炎癥過程，其中高脂血癥和糖尿病是發生動脈粥樣硬化的主要危險因素[1]。既往研究發現三七總皂甙（panax notoginseng saponins，PNS）具有改善血脂代謝、減輕和延緩動脈硬化進展的作用[2]。本研究進一步探討PNS對糖尿病和高脂飲食狀態下SD大鼠炎癥因子水平以及主動脈脂質代謝基因的影響，為PNS用于治療動脈粥樣硬化提供新的理論依據。

1 材料和方法

1.1 動物 雄性2月齡SD大鼠46只，體重200～250g，由南京大學模式動物研究所提供，普通飼料飼養2周后，其中36只用于制造糖尿病模型。

1.2 材料和儀器 PNS（批號160902，純度88.2%，云南昆藥集團）；阿托伐他汀鈣片（Phizer公司，美國）；鏈脲佐霉素（STZ，Sigma公司，美國）；空腹血糖、血脂水平測定（Roche Diagnostics公司,德國）；大鼠TNF-α試劑盒（北京博凌科為公司）；大鼠IL-13試劑盒（上海百蕊生物科技有限公司），大鼠IL-1β試劑盒（上海依科賽生物科技有限公司），血糖儀（強生公司，美國）。 PCR引物(北京擎科生物有限公司)；TRIzol（Gibco BRI公司，美國）；RT-PCR 試劑盒（Genecopoeia公司，美國）；SYBR Green PCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技）；PCR擴增儀（北京東勝創新生物科技有限公司）。RIPA裂解液、BCA試劑盒（上海碧云天生物技術），兔抗TLR-4（Proteintech，美國）；兔抗 SB-RI（Proteintech，美國）；鼠抗ABCA1（Abcam，英國）；小鼠單抗 β-actin、HRP 標記羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司）；ECL底物液（Thermo，美國）。

1.3 糖尿病大鼠建模、分組和干預 造模過程如下：大鼠禁食、禁水4h后，腹腔注射STZ溶液 [將STZ溶于0.1mol/L的檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.5）中，終濃度為6.5mg/ml]；每只大鼠按65mg/kg劑量腹腔注射，注射后繼續禁水4h，隔日尾靜脈采血，測血糖在15mmol/L以上為造模成功[3]，共成功30只，按隨機數字表法分為高脂飲食合并糖尿病組（糖尿病組）、高脂飲食合并糖尿病PNS治療組（PNS組）、高脂飲食合并糖尿病他汀治療組（他汀組），每組10只，另10只未建模大鼠設為單純高脂飲食非糖尿病組（對照組）。4組大鼠均予高脂飲食喂養12周。高脂飲食成分：膽固醇3.0%，膽鹽0.5%，甲基硫氧嘧啶0.2%，蔗糖5%，豬油10%，基礎料81.3%。第5周起，他汀組和PNS組在每天上午分別給予阿托伐他汀鈣片（美國輝瑞公司）20mg/kg體重灌胃，PNS 80mg/kg體重灌胃，對照組和糖尿病組予等量0.9%氯化鈉溶液，連續8周，飼養期間飲水和飼料量不限。

1.4 大鼠體重、血糖血脂水平和血清炎癥因子水平測定 記錄試驗前和試驗結束時各組小鼠的體重。各組大鼠給予高脂飼養飲食或聯合藥物干預12周后處死。處死前禁食12h，不禁水，戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，經心臟采血，血液經3 000r/min離心所得血清儲存于-80℃冰箱中備用。分離的主動脈組織一部分用于冷凍切片，另一部分保存在-80℃冰箱，用于后續PCR和Western blot檢測。空腹血糖、TC、LDL-C和TG水平的測定采用標準法使用Hitachi 912分析儀（Roche diagnostics公司，德國）。血清炎性因子TNF-α，IL-13，IL-1β水平測定根據Elisa試劑盒的說明進行。

1.5 主動脈油紅染色 用干凈清潔的硅化載玻片粘取冷凍切片，等到切片干燥后加入60%異丙醇浸洗10min，油紅O工作液染色10min，60%異丙醇分化3～10s后水洗，Mayer蘇木精復染1min，自來水返藍，用濾紙吸干水分，甘油明膠封片。

1.6 qRT-PCR法檢測主動脈組織TLR4、SR-BI、ABCA1 mRNA表達 在Pubmed上尋找基因序列：借助Premier 5.0設計引物序列（見表1）。按 Trizol Reagent（Gibco BRL，美國）試劑盒說明書提取大鼠主動脈血管總 RNA，紫外分光光度計測量OD260/OD280，計算RNA純度和濃度。按照逆轉錄試劑盒（美國Genecopoeia公司生產）說明操作，將RNA反轉錄成cDNA，再進行PCR 擴增。反應條件：50℃，2min，95℃，10min；95℃，30s，60℃，30s，共40cycles，最后行融合曲線分析。PCR產物5μl，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，通過Gen Genius全自動數碼凝膠圖像分析系統分析各條帶的光密度。熒光實時定量PCR數據：熒光實時定量PCR數據分析[采用相對性Ct（ΔΔCt）]作為定量方法進行比較，以β-actin為管家基因，校正每個樣品的Ct值。

1.7 Western blot檢測主動脈TLR-4、ABCA1和SR-BI蛋白表達 在每1ml冷Lysis Buffer溶液中加入5μl磷酸酶抑制劑，1μl蛋白酶抑制劑和5μl 100mM PMSF混勻，冰上保存數分鐘待用。每100mg固體組織置于培養皿中，手術剪剪碎成3mm×3mm左右的小塊，加入0.5～1ml冷Lysis Buffer，玻璃勻漿器上下手動勻漿15次，注意低溫操作；取組織勻漿液轉移到1.5ml預冷的離心管，4℃下12 000r/min離心5min；取上清液轉移至新的預冷離心管中，即為組織全蛋白提取物，分裝保存于-70℃備用，避免反復凍融。BCA法測定蛋白質濃度。蛋白加熱變性，制作電泳膠，取總蛋白40μg經8%聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉2h。TBST洗膜后分別加入β-actin（1∶200）,TLR-4（1∶1 000）、SR-BI（1 ∶500）和 ABCA1（1 ∶300）一抗，4℃孵育過夜。TBST洗膜10min 3次，再分別加入相應的二抗，室溫下振蕩孵育2h。把膜移入暗室，加入ECL化學發光試劑，根據條帶強弱，調整曝光時間。利用凝膠成像分析軟件Bandscan進行分析。

1.8 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以 表示，兩組間比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 干預后各組大鼠血脂、血清炎癥因子、空腹血糖和體重比較 見表2。

由表2可見，干預前各組體重無明顯差異，而干預后，糖尿病組、PNS組和他汀組體重比對照組明顯降低（均P＜0.01）。糖尿病組、PNS組和他汀組空腹血糖較對

表2 干預后各組大鼠血脂、血清炎癥因子、空腹血糖和體重比較

照組明顯升高（均P＜0.01）。與糖尿病組比較，PNS組和他汀組血清 TG、TC、TNF-α、IL-1β 和 LDL-C 水平均降低（均P＜0.05），與PNS組比較，他汀組LDL-C降低更為明顯（P＜0.01）。糖尿病組血清IL-13水平較對照組降低（P＜0.05），經PNS和他汀干預后IL-13表達均有所升高，但與糖尿病組相比無統計學差異。

2.2 各組大鼠主動脈冷凍切片油紅染色結果 見圖1。

圖1 各組大鼠主動脈冷凍切片油紅染色圖

由圖1可見，糖尿病組血管內膜及外膜脂質含量明顯增加；PNS組和他汀組主動脈內膜及外膜的脂質含量均明顯改善，他汀組主動脈脂質含量降低更為明顯；對照組脂滴在主動脈血管上的表達最少。

2.3 各組大鼠主動脈TLR-4、SR-BI和 ABCA1 mRNA表達量比較 見圖2。

由圖2可見，糖尿病組大鼠主動脈組織的TLR-4 mRNA表達明顯較對照組升高（P＜0.01）。與糖尿病組比較，他汀組TLR-4 mRNA表達明顯降低（P＜0.01），SB-RImRNA和ABCA1mRNA表達明顯上調（均P＜0.01）；與糖尿病組比較，PNS組TLR-4 mRNA表達降低，SBRI mRNA和ABCA1 mRNA水平升高，但未達統計學差異（均P＞0.05）。

圖2 各組大鼠主動脈TLR-4、SR-BI和ABCA1 mRNA表達量比較（與糖尿病組比較，**P＜0.01）

2.4 各組大鼠主動脈TLR-4、SR-BI和ABCA1蛋白表達比較 見圖3。

圖3 各組大鼠主動脈TLR-4、SR-BI和ABCA1蛋白表達比較（與糖尿病組比較，**P＜0.01；與他汀組比較，▲P＜0.05）

由圖3可見，與對照組比較，糖尿病組主動脈組織TLR-4蛋白明顯升高（P＜0.01），SB-RI蛋白和ABCA1蛋白表達明顯降低（均P＜0.01）。與糖尿病組比較，PNS組和他汀組TLR-4蛋白表達均明顯降低（均P＜0.01），SR-BI蛋白和ABCA1蛋白表達均明顯升高（均P＜0.01）。而PNS組SR-BI蛋白和ABCA1蛋白表達水平均低于他汀組（均P＜0.05）。

3 討論

動脈粥樣硬化是血脂代謝異常、高血糖和高血壓等多因素作用下的慢性炎癥性疾病，它的發生、發展過程與血管局部及全身的炎癥反應可能存在密切的關系，而血管內皮細胞受損被認為是動脈粥樣硬化病變的始動因子[1，4]。本研究發現糖尿病組高脂喂養的SD大鼠主動脈內膜和外膜脂質含量增加，血清炎癥因子TNF-α和IL-1β表達增加，而抗炎因子IL-13表達降低，血管壁TLR-4基因和蛋白表達明顯升高，而逆膽固醇脂轉運的SR-BI和ABCA1在血管壁上表達降低。PNS和阿托伐他汀鈣干預后血清炎癥因子表達降低，主動脈血管壁SR-BI和ABCA1基因及蛋白表達上調。

炎癥反應貫穿于動脈粥樣硬化的整個過程，高脂、高血糖狀態下，炎癥反應更加劇烈[2，5]。本研究也觀察到類似的結果，糖尿病組SD大鼠的血清炎癥因子表達較對照組SD大鼠明顯升高。這與他汀具有調脂作用外，尚有抗炎的作用相關[6]。動脈粥樣硬化狀態下往往TNF-α和IL-1β等促炎癥因子表達增加，而抗炎因子如IL-13表達減少[7－8]。本研究中糖尿病組SD大鼠經他汀治療后，除降低LDL外，明顯降低血清炎癥因子TNF-α和IL-1β表達，同時增加抗炎因子IL-13表達。既往的研究發現PNS具有抗炎、抗氧化的作用，改善不穩定心絞痛患者的血清炎癥因子表達，改善冠心病心絞痛的臨床癥狀[9-10]。我們發現PNS具有類似于阿托伐他汀鈣降低TNF-α和IL-1β，以及升高IL-13水平的作用。然而，糖尿病組SD大鼠的體重明顯低于對照組，可能與STZ所致的糖尿病類似于臨床上的1型糖尿病，消瘦表現更為明顯，而與腹型肥胖為特征的2型糖尿病不同。他汀與PNS均不能有效改善STZ所致糖尿病大鼠的血糖和體重，這可能與PNS對糖尿病動脈粥樣硬化的干預作用不是通過調節血糖實現有關。

動脈粥樣斑塊中TLR-4表達明顯增加，促進清道夫受體CD36表達增強，促使巨噬細胞攝入oxLDL，加速泡沫細胞的破裂和斑塊的不穩定[11]。SR-BI是第一個在分子水平確定的HDL的天然膜受體,促進膽固醇向肝臟轉運和代謝，具有抗動脈粥樣硬化的作用[12]；而ABCA1表達增加促進游離膽固醇結合到乏酯的新生HDL上，起著膽固醇的逆轉運作用，也具有改善動脈粥樣硬化的作用[13]。大量的研究發現高脂血癥和糖尿病明顯降低ABCA1和SR-BI的基因表達，升高TLR-4的基因表達，而他汀類藥物有降低TLR-4表達與升高SR-BI和ABCA1基因表達作用，本研究與既往的報道相類似[14-15]。PNS具有調整血脂代謝的作用[2]，但PNS干預組SD大鼠后，LDL-C降低不如他汀組明顯，這可能與他汀具有更明顯抑制膽固醇合成的作用有關。我們發現PNS與他汀具有類似的上調SR-BI和ABCA1基因表達和降低TLR-4基因表達，但與糖尿病組SD大鼠無統計學差異，而蛋白水平比較存在差異，可能是PNS加強TLR-4、SR-BI和ABCA1基因在轉錄后水平上的調節有關，但具體機制有待于后續的研究。PNS降低主動脈脂滴的沉著，可能是通過調節膽固醇轉運蛋白的表達，進而影響血脂的代謝和改善粥樣硬化的斑塊進展。

總之，本研究發現PNS具有降低糖尿病高脂喂養SD大鼠的炎癥因子表達，改善動脈粥樣硬化的慢性炎癥狀態，減緩高脂血癥、高血糖狀態對動脈粥樣斑塊的進展。本研究為進一步闡述PNS在分子水平上對動脈粥樣硬化的作用機制提供新的理論依據，也部分解釋了PNS改善心絞痛癥狀和穩定斑塊可能是通過改善脂質代謝和減輕炎癥的作用有關。