膠體金法快速檢測豬尿中氟喹諾酮類藥物的殘留

林少華 羅紅霞 許文濤 寥國周 商 穎 葛長榮*

（1北京農業職業學院，北京 102442；2中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；3云南農業大學食品科學技術學院，云南昆明 650201；4昆明理工大學食品安全研究院，云南昆明 650093）

為了保證消費者的飲食衛生與食用安全，中國規定了動物源食品中獸藥的最大殘留限量（Maximum Residue Limits,MRL）[1]，然而隨著獸藥的廣泛使用，引起了人們一系列的不良反應，對人體和動物的機體造成了一定的損傷，因此，獸藥在動物源食品中的殘留問題越來越受到人們的關注。氟喹諾酮類藥物（Fluoroquinolones,FQs）是一類近年來被廣泛應用的對許多細菌具有抑制作用的人工合成獸藥[2]，它對金黃色葡萄球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、衣原體、支原體、螺旋體等致病菌具有極強的抑制作用，適用于臨床常見的各種細菌感染性疾病，已成為繼青霉素類藥物和磺胺類藥物之后治療畜禽疾病的第三代喹諾酮類藥物[3]。然而，長期使用FQs會積累在動物體內，當身體的累積攝入量超過限制時，中毒癥狀如皮膚過敏、出血和腎功能衰竭等不良反應[4]將會出現，并會誘發精神病及癲癇患者發病[5]，具有潛在的致癌性[6]等。因此，氟喹諾酮類藥物已經被大多數國家禁止或限制使用。

目前，關于氟喹諾酮類藥物殘留的檢測方法主要有微生物法、化學發光法、液相色譜-質譜聯用法和免疫分析法[7-11]。膠體金免疫層析法是一種利用膠體金作為標記物并基于抗原抗體反應進行檢測的技術，該技術操作簡單快速，可直觀判斷檢測結果[12]。目前，已有的研究包括了肉、蛋、奶的FQs膠體金免疫層析方法[13-14]，但采用膠體金試紙條對豬尿中的FQs直接進行檢測，可以解決篩查生豬大規模樣品時采用儀器法周期長、對實驗操作人員要求高及檢測成本昂貴等問題。因此，本文擬建立一種快速檢測豬尿中FQs的膠體金免疫層析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、培氟沙星、依諾沙星、惡喹酸等標準品，氯金酸（HAuCl4·4H2O）、檸檬酸三鈉、牛血清白蛋白（BSA），羊抗鼠IgG均購自Sigma公司；FQs單克隆抗體和包被抗原（FQs-OVA）由本實驗室制備；硝酸纖維素膜、結合墊、樣品墊、吸收墊均購自美國Millipore公司；其他試劑均為分析純；豬尿樣本采自北京某豬場。

1.2 儀器

Mili-Q超純水系統購自美國Millipore公司；磁力攪拌器購自上海振榮科學儀器有限公司；試紙條劃線儀購自美國Biodot公司；可編程切條器購自杭州峰航科技有限公司；切紙器購自寧波得力集團有限公司；分析天平購自德國Sartorius公司；手持式pH計購自上海般特儀器有限公司；臺式離心機購自美國Scilogex公司；生化培養箱DHP-600購自天津市中環實驗電爐有限公司；紫外-可見分光光度計購自北京普析通用儀器有限責任公司；透射電子顯微鏡（TEM）購自美國JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 膠體金溶液的制備

準確稱取1.0 g氯金酸，并使用超純水將其定容于100 mL容量瓶中，制備成濃度為1%的氯金酸溶液，于4℃避光保存備用。配制膠體金溶液時，取1 mL濃度為1%的氯金酸溶液加入到100 mL超純水中，用磁力攪拌電熱器加熱至沸騰，然后快速加入2.0 mL現配的體積分數為1%的檸檬酸三鈉溶液，保持沸騰10 min，直到液體變紅并停止加熱，降至室溫備用。

1.3.2 膠體金標記抗體的制備

取1 mL膠體金溶液，用0.2 mol/L的K2CO3溶液調節pH值為7.0～7.2，漩渦震蕩10 min后，加入適量的FQs單克隆抗體，攪拌30 min后，加入體積分數為10%的1 mL牛血清蛋白（BSA），結合30 min后，將混合溶液在4℃下以12 000 r/min離心20 min，將離心得到的沉淀物溶解于0.1 M的磷酸鹽緩沖液中，制備得到膠體金FQs單克隆抗體溶液，并于4℃保存備用。

1.3.3 優化膠體金最佳抗體標記量

每管加入1 mL上述膠體金溶液，分別加入0、2、4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20 μL 濃 度 為1 mg/mL的FQs單克隆抗體，振蕩混勻5 min，室溫靜置10 min；然后加入0.1 mL 10%的NaCl溶液，混勻并靜置2 h。然后將該膠體金溶液在4℃以12 000 r/min離心20 min，得到上清液，于520 nm處測定其吸光值。

1.3.4 試紙條的組裝

試紙條由材質為玻璃纖維膜的膠體金結合墊、材質為硝酸纖維素膜（NC膜）的層析膜、加樣墊及吸水墊組成。膠體金FQs單克隆抗體溶液用噴膜儀噴在結合墊上，并在恒溫37℃下烘干，然后真空凍干制成膠體金結合墊備用。用點膜儀將濃度為1 mg/mL的FQs-OVA偶聯物包被于NC膜上，制成T線檢測線，在距離T線4mm處，用點膜儀將濃度為1 mg/mL的羊抗鼠二抗包被于NC膜上，制成C線質控線，然后置于37℃烘干3 h。最后以PVC板作背襯，按順序粘上樣品墊、結合墊、層析膜和吸水墊組裝成檢測試紙條。樣品吸收墊的末端與結合墊始端相連，結合墊的末端與吸水墊的始端相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對齊，試紙兩端粘貼有保護膜，切成4 mm寬的試紙條，密封好后放入4℃保存備用。

1.3.5 檢測原理及結果判斷

由土地綜合承載力方程可知，地均第二、第三產業增加值以及兩者的聯合發展都不是土地綜合承載力的Granger原因。但在10%顯著性水平下，人均GDP是土地綜合承載力的Granger原因。這表明土地綜合承載力主要受人口承載力、資源環境承載力、經濟社會承載力及科技文化承載力4個構成要素的影響，客觀上來看，土地綜合承載力與人均GDP之間的因果關系日趨顯現。

當樣品中含有FQs時，膠體金FQs單克隆抗體標記物與FQs結合，不與FQs-OVA偶聯物結合而未出現紅色條帶。基于上述原理，當T線和C線均出現紅色條帶時，判為陰性；當C線出現紅色條帶，而T線不顯色，判為陽性；當C線顯示紅色條帶，T線也顯示紅色條帶，并且T線顏色接近或淺于C線時，則判為陰性；當C線不顯示紅色條帶，則無論T線是否顯示紅色條帶，都判為無效（圖1）。

圖1 試紙條檢測結果示意圖

1.3.6 豬尿樣品檢測程序

取100 μL存放于4℃冰箱的豬尿樣品，該樣品無需進行前處理，用吸管吸取待檢樣品溶液滴加3滴到試紙條的加樣孔中，通過觀察T線和C線的顏色變化判定結果。

1.3.7 試紙條的檢出限

分別向陰性豬尿樣品中添加恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、培氟沙星、依諾沙星和惡喹酸標準品，使得它們的質量濃度分別為10、20、30、40 μg/L。通過觀察試紙條T線和C線的顏色變化情況對結果進行判斷。

1.3.8 試紙條的特異性

將常用的獸藥如氯霉素、紅霉素、慶大霉素、四環素等按照質量濃度為500 μg/L分別加入到陰性豬尿中，然后用試紙條重復檢測3次，以確定試紙條的特異性。

1.3.9 試紙條的穩定性

將制備好的試紙條密封包裝在鋁箔袋中，分別進行37℃加速試驗和4℃儲存試驗。將制備好的試紙條置于37℃，分別在10、20、40、80、160、320天取出，檢測添加了質量濃度為0、20、40 μg/L恩諾沙星標準品的陰性豬尿樣品，每組3個平行。將置于4℃下的試紙條，于1、4、8、12、16、20、24個月取出，檢測添加了質量濃度為0、20、40 μg/L恩諾沙星標準品的陰性豬尿樣品，每組3個平行。

2 結果與討論

2.1 膠體金及其FQs單克隆抗體的表征

本研究制備的膠體金納米顆粒及膠體金FQs單克隆抗體表征結果如圖2所示。利用透射電子顯微鏡（TEM）對金納米顆粒和膠體金FQs單克隆抗體的宏觀形貌進行了表征，可以清晰看到金納米顆粒分散性良好，尺寸約為40 nm；膠體金FQs單克隆抗體在金納米顆粒周圍出現明亮的圓圈，表明抗體修飾成功。

圖2 金納米顆粒和膠體金FQs單克隆抗體的表征

為了進一步驗證抗體的成功修飾，測試了金納米顆粒和膠體金FQs單克隆抗體的紫外-可見吸收光譜的變化。金納米顆粒的最大吸收波長為520 nm，而膠體金FQs單克隆抗體最大吸收波長為524 nm，峰值的變化表明抗體修飾成功（圖3）。

圖3 金納米顆粒和膠體金FQs單克隆抗體溶液的紫外-可見光掃描圖譜

2.2 膠體金最佳標記抗體的量

實驗結果表明，隨著抗體量的增加，膠體金溶液的顏色由酒紅色緩慢變為藍灰色，表明抗體加入量不能很好地穩定膠體金。當管內膠體金的酒紅色不再發生明顯變化時，表明該抗體加入量可以較好地穩定膠體金。由圖4可以看出，隨著抗體加入量的增加，金顆粒與蛋白的結合物在520 nm處的吸光值也增加，當FQs單克隆抗體加入量在10 μL時，OD520nm值基本趨于穩定，說明金顆粒結合的抗體蛋白已經飽和。

2.3 試紙條的檢測限

當該試紙條用于檢測含有濃度低于20 μg/L的恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、培氟沙星、依諾沙星和惡喹酸的豬尿樣品時，試紙條T線和C線均顯色，為陰性，而濃度高于20 μg/L時，該試紙條的T線不顯色而C線顯色，為陽性，因此檢出限為20 μg/L。

圖4 不同FQs加入量膠體金的OD值

2.4 試紙條的特異性

結果顯示，采用試紙條分別檢測含有濃度為500 μg/L的氯霉素、紅霉素、慶大霉素、四環素的豬尿時，試紙條C線和T線均顯色，因此，本試紙條未對這些藥物發生交叉反應。

2.5 試紙條的穩定性

試紙條的穩定性結果如表1和表2所示。在37℃加速試驗時，該試紙條在160天時測定了含有濃度為20 μg/L恩諾沙星標準品的豬尿樣品，有2份已經失效；測定了含有濃度為40 μg/L恩諾沙星的豬尿樣品，有1份已經失效。到了320天時，所有試紙條均失效。4℃保存試驗時，氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙條可以保存24個月。

表1 37℃加速試驗結果

3 結果與討論

影響膠體金試紙條質量的主要因素包括膠體金顆粒的尺寸、膠體金標記的抗體量。當膠體金的顆粒較大時，會產生一定的空間位阻，不利于樣品的毛細管遷移，降低試紙條的檢測時間和檢出限；但如果膠體金的顆粒太小，難以標記更多的單克隆抗體，也會降低試紙條的檢測靈敏性。本文采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，利用透射電子顯微鏡對金納米顆粒和膠體金FQs單克隆抗體進行表征，確定所制備的膠體金顆粒及其標記的單克隆抗體均一，平均直徑為40 nm；通過紫外-分光光度計掃描得到膠體金FQs單克隆抗體最大吸收波長為524 nm。另外，膠體金的標記抗體量也非常關鍵，抗體標記量過低時會產生游離的膠體金，使得膠體金標記的單克隆抗體溶液不穩定，從而降低檢測結果的穩定性，同時，顯色條帶較淺，容易產生結果誤判；抗體標記量過高時，會導致抗體的浪費，并降低檢測結果的靈敏性，因此，本試紙條加入的濃度為1 mg/mL的FQs單克隆抗體量為10 μL。該方法制備的試紙條對含有恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、培氟沙星、依諾沙星和惡喹酸等藥物的豬尿樣品的檢出限為20 μg/L，且檢測的特異性高，在37℃時可以保存160天左右，在4℃時，可以保存24個月。

表2 4℃保存試驗結果