單抗誘發(fā)性細胞因子釋放綜合征和體外細胞因子釋放實驗的研究進展

尉驍璐，孫建華，宮麗崑

(1.中國科學院大學藥學院，北京 100049；2.中科院上海藥物研究所藥物安全評價研究中心新藥研究國家重點實驗室，上海 201203)

單克隆抗體(monoclonal antibodies, mAbs)被廣泛應(yīng)用于抗炎以及腫瘤治療中，但是它可能引發(fā)細胞因子釋放綜合征(cytokine-release syndrome, CRS)[1-2]。CRS是指由于大量細胞因子釋放所引起的一種級聯(lián)放大的系統(tǒng)性免疫應(yīng)答，引發(fā)CRS的細胞因子包括干擾素、白介素、趨化因子、腫瘤壞死因子等，涉及的細胞包括免疫細胞和某些非免疫細胞如內(nèi)皮細胞等[3-4]。CRS一般發(fā)生在首次給藥后幾小時內(nèi)，進展迅速[5]。臨床表現(xiàn)包括發(fā)熱、寒顫、惡心、嘔吐、低血壓、呼吸急促、頭疼等，嚴重可能導致多器官衰竭和死亡[6]。當前的體外實驗和體內(nèi)動物模型具有局限性，尚未能準確識別具有CRS不良反應(yīng)的藥物，且不能可靠預測藥物在人體應(yīng)用時的發(fā)生、發(fā)展，因此，探尋優(yōu)化的體外細胞因子釋放實驗(cytokine release assays, CRA)成為臨床前安全性評價的研究熱點。

1 CRS的發(fā)生機制和臨床不良反應(yīng)案例

1.1發(fā)生機制mAbs引發(fā)CRS的發(fā)生機制仍不清楚，有研究表明，以下幾種機制可能誘發(fā)CRS[5]：(1)可溶性抗體通過抗原決定簇(complementarity determining regions, CRDs)直接結(jié)合至效應(yīng)細胞表面的同源受體上，直接激發(fā)效應(yīng)細胞釋放大量細胞因子；(2)可溶性抗體與效應(yīng)細胞表面同源受體結(jié)合，并與已存在的抗IgG抗體交叉結(jié)合，引起效應(yīng)細胞激活并釋放細胞因子；(3)可溶性抗體微弱地結(jié)合在效應(yīng)細胞表面，通過Fc與鄰近非效應(yīng)細胞表面FcR結(jié)合，引起效應(yīng)細胞表面抗原聚集，刺激效應(yīng)細胞釋放細胞因子；(4)可溶性抗體結(jié)合至效應(yīng)細胞，通過Fc與臨近的非效應(yīng)細胞表面FcR交叉結(jié)合，激活非效應(yīng)細胞(含有FcR的細胞)釋放大量細胞因子。由于人體免疫系統(tǒng)的復雜性，體內(nèi)CRS可能由多種機制共同參與導致。

1.2臨床不良反應(yīng)案例在2006年，CD28的超級激動劑TGN1412在I期臨床試驗中誘發(fā)了致命性CRS，造成了災(zāi)難性后果，6名志愿者均發(fā)生了嚴重的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，隨后出現(xiàn)肺損傷、腎功能衰竭等癥狀[7]。據(jù)報道，特異性識別人T細胞表面CD3的鼠源抗體OKT3用藥后也會引起嚴重的CRS；提前高劑量注射甲潑尼龍可以減弱CRS[8]。此外，抗CD52的人源化抗體阿侖單抗會引起較為嚴重的CRS，它誘導CRS的機制是NK細胞表面CD16(FcγRIIIa)的級聯(lián)反應(yīng)[9]。除此之外，抗CD20抗體利妥昔單抗會引起輕微CRS，但是它產(chǎn)生副作用反應(yīng)強弱與循環(huán)的腫瘤細胞數(shù)目相關(guān)。因此，根據(jù)臨床上產(chǎn)生不良反應(yīng)的強弱排序，TGN1412>OKT3>阿侖單抗>利妥昔單抗[10]。

2 CRS風險評估綜合考慮

在充分結(jié)合體內(nèi)外數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，CRA可以為首次臨床試驗(first-in-human study, FIH)提供風險管理指導。當候選藥物存在誘發(fā)CRS風險時，建議FIH的最大推薦起始劑量(maximum recommended starting dose, MRSD)選用最低預期生物效應(yīng)的劑量(minimum anticipated biological effect level, MABEL)。MABEL是基于藥物有效性得出的人體起始劑量指導，它的計算需要充分利用體內(nèi)外的藥代動力學(pharmacokinetics,PK)和藥效學(pharmacodynamics, PD)數(shù)據(jù)，以及藥物在相關(guān)受試動物中和人體內(nèi)藥物作用機制存在的差異[11]。

3 體外CRA

體外CRA是基于藥物作用機制和作用靶點，利用體外實驗系統(tǒng)評估候選藥物誘發(fā)細胞因子釋放的潛在風險，已經(jīng)成為危險識別和潛在風險評估的工具[12-13]。CRA不僅是候選藥物臨床前安全性評價試驗的重要組成部分，即使是在研發(fā)早期階段，CRA也可以對靶向同一靶點的抗體藥物打分，以篩選最優(yōu)候選抗體[13]。TGN1412事件發(fā)生后，體外CRA研究取得很大進展，目前已有多種CRA方法用于預測CRS發(fā)生的風險。但是由于各類CRS發(fā)生機制不同，目前還沒有特定的體外CRA可以適用于所有CRS預測，有必要開發(fā)出適用靈活結(jié)果精準的CRA預測平臺。以下從適用對象和實驗方法角度對體外CRA優(yōu)化進行探討。

3.1適用對象體外CRA的適用對象需考慮藥物作用機制和藥物作用靶點。CRS可能的發(fā)生機制主要包括：(1)由于抗體藥物直接激活靶細胞，特別是靶向T細胞釋放細胞因子引起，如Muromonab CD3(OKT3)和TGN1412；(2)抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)和補體依賴的細胞毒性作用(complement dependent cytotoxicity, CDC)效應(yīng)引起非效應(yīng)細胞釋放大量細胞因子[5]，如阿侖單抗、利妥昔單抗等[14]。此外，需考慮脫靶效應(yīng)導致CRS的可能性[13]。藥物作用靶點方面，通常靶向細胞表面抗體，尤其是靶向免疫細胞表面抗體誘發(fā)CRS的可能性較大[10]。另外，還需考慮抗體靶向的特定細胞、特定靶點的表達水平、Fc親和力和特異性等因素[13]。需依據(jù)藥物不同的作用機制和靶點，選擇和設(shè)計合適的評價方法。

3.2實驗方法當前常用的CRA方法包括可溶性抗體刺激全血模型[15-16]、固定化抗體刺激外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)模型[17-18]、預孵育高密度PBMC模型[14]和內(nèi)皮細胞等與PBMC共培養(yǎng)模型[17,19,20]。其中，抗體刺激全血模型在TGN1412事件發(fā)生前是應(yīng)用最為廣泛的模型，但是它對TGN1412誘導的CRS靈敏度低，可能是由于全血中紅細胞的抑制導致，有研究表明紅細胞表面存在GYPA糖蛋白，它可與IL-2作用，進而抑制IL-2依賴的T細胞增殖[15,21]。目前，固定化抗體刺激PBMC模型在預測TGN1412誘導的CRS方面最靈敏，可能由于固定化的TGN1412，其Fc區(qū)域結(jié)合至板上能引起TGN1412的交叉結(jié)合，最終引起T細胞激活[18]；內(nèi)皮細胞等與PBMC共培養(yǎng)模型與其類似。而預孵育高密度PBMC模型中，實現(xiàn)細胞間接觸誘發(fā)T細胞的激活，與組織中T細胞狀態(tài)類似[14]。它們的優(yōu)缺點比較見Tab 1。

3.2.1方法設(shè)計考慮因素

3.2.1.1抗體藥物存在方式 包括可溶性抗體藥物、可溶性抗體藥物與可溶性anti-Fc抗體、抗體藥物直接濕法包被、抗體藥物直接干法包被、可溶性抗體藥物加至包被有anti-Fc抗體板中、可溶性抗體藥物加入含有單層內(nèi)皮細胞板中[17]。目前，選擇可溶性抗體藥物多于干法包被，濕法包被并不常用[12]。

3.2.1.2細胞類型 研究中應(yīng)用的細胞類型包括全血[15-16]、PBMC[17-18]、PBMC與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)[17,19,20]。全血接近生理狀態(tài)，對阿侖單抗誘發(fā)的CRS預測靈敏度高[15]，并且在樣品準備階段操作更簡單，可以避免由于分離PBMC等步驟造成的背景值偏高情況。而PBMC對TGN1412誘發(fā)的CRS預測更靈敏[18]，但是與全血相比，可能存在可溶性因子丟失和血細胞分布群變化的問題[12]。研究中通常選擇正常人全血或PBMC，如果靶抗原僅在疾病狀態(tài)特異性表達，那么應(yīng)當選擇患者細胞作為來源[13]。

3.2.1.3對照選擇 實驗中陰性合適對照包括磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)和陰性抗體，如那他珠單抗、貝伐單抗[16]以及同型抗體如IgG1和IgG4[19]。陽性對照多選擇脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、植物凝集素(phytohaemagglutinin, PHA)、OKT3、阿侖單抗、利妥昔單抗和TGN1412[12]。

3.2.1.4檢測指標 細胞因子的選擇以TNF-α、INF-γ、IL-2、IL-6、IL-8最為常見。此外，IL-10、IL-1β、GM-CSF、IL-12、IL-13、IL-4、IL-17A的檢測也有報道[12]。D Eastwood等[22]認為，INF-γ、IL-2是TGN1412響應(yīng)的標志細胞因子。免疫細胞和某些非免疫細胞產(chǎn)生細胞因子，這些細胞因子通過血液和淋巴液進行傳遞，通過自分泌、內(nèi)分泌或者旁分泌進行細胞間的通訊和信號交流，最終形成復雜的細胞因子網(wǎng)絡(luò)。實際研究中，應(yīng)當綜合考慮藥物靶點、藥物作用機制和淋巴細胞激活情況，確定多細胞因子檢測的最優(yōu)組合。檢測指標中，除了檢測細胞因子之外，也可以通過胞內(nèi)細胞因子染色同免疫細胞亞群相結(jié)合方式，直接鑒別產(chǎn)生細胞因子的細胞群，確定細胞因子的來源，為進一步闡釋作用機制提供依據(jù)[22]。此外，還可檢測不同抗體藥物對PBMC以及特定免疫細胞亞群增殖的影響[17-18]。

Tab 1 Comparison of advantages and disadvantages of common cytokine release assays in vitro

3.2.1.5藥物刺激時間 一般選擇16～72 h之間。Wolf等[16]發(fā)現(xiàn)，IL-2在6 h達到峰值，TNF-α、INF-γ、IL-4、IL-8 和IL-10在24 h達到峰值，而IL-6在刺激48 h后達峰值。應(yīng)根據(jù)細胞因子的時相變化，選擇合適的刺激時間。

3.2.1.6樣本量 實驗研究中，樣本量需要達到充足的統(tǒng)計效能，由于不同實驗方法對不同抗體敏感性存在差異，會導致樣品量差異很大。樣品量應(yīng)滿足的統(tǒng)計效能為90%，統(tǒng)計顯著性為5%。不敏感CRA由于統(tǒng)計效能低，故需要更大樣本量去滿足統(tǒng)計分析要求。Vessillier等[15]發(fā)現(xiàn)，TGN1412誘導CRS預測實驗中，抗體藥物直接干法包被刺激PBMC的實驗比可溶性抗體藥物刺激全血的實驗靈敏度高，前者僅需4個樣本就可滿足統(tǒng)計效能，而后者卻需要52個樣本。

以上實驗方法選擇綜合考慮見Fig 1。

3.2.2實驗方法優(yōu)化 如果靶抗原僅在疾病狀態(tài)，例如在腫瘤細胞或活化的效應(yīng)細胞或自發(fā)致病性細胞上才表達，或者細胞因子釋放機制涉及全血或PBMC中不存在的細胞類型之間的協(xié)作，那么這些腫瘤細胞、成纖維細胞或者在活化時過度表達靶標的細胞系，以及原代細胞等應(yīng)考慮包含在檢測系統(tǒng)中。另外，受試者本身的免疫狀態(tài)，例如免疫系統(tǒng)激活或者免疫系統(tǒng)抑制也應(yīng)予以考慮。最后，免疫響應(yīng)起始于淋巴組織，而現(xiàn)在細胞因子預測技術(shù)多使用全血或者PBMC，所以研究淋巴組織中免疫細胞和淋巴循環(huán)系統(tǒng)中免疫細胞的差異和聯(lián)系，以及二者轉(zhuǎn)化也是CRA優(yōu)化的一個方向。Romer等[14]通過提前孵育高密度PBMC實現(xiàn)細胞間接觸誘發(fā)TCR/CD3復合物Tyr磷酸化，認為其狀態(tài)與組織中T細胞狀態(tài)類似。

Fig 1 General consideration on selection of cytokine release assays in vitro

4 結(jié)語

免疫調(diào)節(jié)類抗體藥物需在臨床前進行嚴格的誘發(fā)CRS風險評估，當候選藥物存在誘發(fā)CRS風險時，建議FIH的MRSD采用MABEL。CRS評估方法包括體內(nèi)動物實驗和體外CRA。體內(nèi)動物模型的選擇存在挑戰(zhàn)，主要由于抗體藥物的靶點在序列和結(jié)構(gòu)上存在種屬差異性。通常藥理學相關(guān)種屬為最佳選擇，如非人靈長類(nonhuman primate，NHP)，然而，NHP的相關(guān)靶點與人類仍存在差異[22]。此外，轉(zhuǎn)基因動物例如特定靶點表達的轉(zhuǎn)基因動物及免疫人源化小鼠也可作為選擇，但是，可能存在建模周期長和模型穩(wěn)定時間短等問題。無論是否進行了藥理學相關(guān)動物種屬的體內(nèi)評價，體外CRA均是識別和提示CRS風險的一類重要方法。由于免疫調(diào)節(jié)劑類藥物的靶點和作用機制復雜多樣， CRA的方法設(shè)計需要充分考慮各方面，包括藥物作用機制、藥物作用靶點、測試系統(tǒng)中藥物存在方式、合適對照、細胞來源、刺激時間、多細胞因子檢測最優(yōu)組合以及樣本量等，從而最終建立更加靈活、精準的CRS預測平臺。