高通量測序技術在胚胎植入前遺傳學檢查中的應用

周飛飛，譚季春 ，徐小延，孔 琳，梁曉茵，董 萌，李萍萍

胚胎植入前遺傳學檢查(PGT)是通過對配子或胚胎的遺傳分析，選擇未見異常的胚胎植入子宮，包括胚胎植入前遺傳學診斷（PGD）和胚胎植入前遺傳學篩查(PGS)。PGD主要適用于染色體遺傳病篩查，在阻斷致病基因縱向傳遞的基礎上，避免遺傳病胎兒的出生[1]；PGS主要適用于染色體非整倍體的篩查，以提高著床率和活產率[2]。

高通量測序又名下一代測序和深度測序，以能一次對成千上萬的DNA分子進行序列測定為標志，具有速度快、通量大、結果一致性好、簡便高效等特點[3]。可對胚胎全基因組進行檢測，僅需低深度、高通量測序，就能完成突變位點和胚胎染色體的檢查，并能發現新的突變位點，保證低成本、快速完成胚胎的遺傳診斷，從而挑選無異常的胚胎植入子宮。筆者主要介紹開展高通量測序技術在胚胎植入前遺傳學檢查中的應用情況。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年1月～2017年9月來醫院輔助生殖中心就診的患者，在自愿的原則下，納入符合PGS/PGD適應證的夫婦，均簽署知情同意書，并通過醫院倫理委員會的認可。PGS指征：自然流產≥3次或2次自然流產且至少其中一次流產組織基因檢測異常、反復種植失敗（移植優質胚胎次數≥3，或移植≥10個可移植胚胎）、高齡（＞38歲）等；PGD指征：單基因病、染色體病、HLA配型、線粒體病等。

1.2 方法

1.2.1 常規促排卵 篩選符合PGD/PGS適應證的夫婦進行試管嬰兒術前相關檢查，相關化驗檢查合格后，進行試管嬰兒促排流程，促排方案包括：長方案、短方案、拮抗劑方案等，由臨床醫生根據患者自身情況選擇適合患者本人的方案。促排過程中，通過超聲及激素水平檢查評估卵泡發育情況，根據卵泡數量、大小和激素水平決定扳機日及用藥和藥量，并于扳機藥物注射36～38 h后取卵。

1.2.2 胚胎檢查 為了避免胚胎活檢取材時透明帶上多精子因素的干擾，在受精方式上采用卵胞漿內單精子顯微注射技術。卵裂期胚胎評分以Istanbul共識為標準[4]，囊胚期胚胎評分按照Gardner評分標準[5]。受精后的胚胎培養到第5～6 d時，選擇發育3期以上的囊胚進行活檢；對4期的胚胎需對遠離滋養層一側的透明帶進行激光打孔，待滋養層細胞孵出，用活檢針取3～5個滋養層細胞進行囊胚活檢。活檢細胞在無鈣的磷酸鹽緩沖液吹吸后，裝入0.2 ml的無菌eppendorf管中，應用高通量測序技術進行基因篩查（測序儀：IonProton，DA8600），挑選生物信息分析無異常的胚胎行解凍移植。對于成功妊娠者，須在孕16～20 w時行羊水穿刺檢查，確保100%隨訪。

1.3 隨訪 生殖中心專職人員通過電話方式對患者進行隨訪，包括妊娠結果、羊水穿刺結果及整個孕期是否順利和胎兒出生情況等。

2 結果

共對251例的囊胚進行了全基因組檢測，有155例可行胚胎移植。目前已有119例行解凍移植，妊娠率 71.4%（85/119），分娩率 35.3%（30/85），流產率 3.5%（3/85），引產率 1.2%（1/85），其余繼續妊娠中。見表1。

活檢胚胎1000例，胚胎檢出率92.5%，染色體平衡易位者122例；染色體羅伯遜易位者43例，染色體倒位者11例，單基因病者12例；Y染色體微缺失7例以及反復流產等共計251例，其中染色體異常占較大比例。見表2。

表1 行高通量測序的PGD/PGS患者的基本信息

3 討論

雖然本研究樣本量有限，但仍可以從表1、2中了解到，在PGS/PGD中應用高通量測序技術可降低流產率，提高妊娠率，也有效避免了基因病患者致病基因的縱向傳遞。共活檢了1000個胚胎，有檢測結果的胚胎數為925，檢出率為92.5%。未檢出的胚胎可能是由于活檢胚胎質量差，或是樣本轉移異常，或是受當前檢測技術水平影響等。共有119例行解凍移植，妊娠數85，妊娠率為71.4%，流產率為3.5%，大大增加了患者的妊娠率，降低了流產率。

隨著科學技術的不斷發展，高通量測序技術越來越成熟，憑借其速度快、準確率高、通量高等優勢，已經滲透到生命科學的多個領域[6]，如在病原微生物鑒定、腫瘤基因組序列測定以及臨床遺傳疾病的無創產前診斷和篩查等方面。但由于其測序成本較高，還不能常規應用到臨床中，而且由于其測序通量大，對于后期測序數據，較難分析。

表2 PGD/PGS患者遺傳學檢查基本信息及高通量測序結果

在對患者進行隨訪時，有1例因男方羅氏易位來醫院就診要求行PGD助孕的患者，在妊娠13 w時行頸后透明帶掃描（NT）發現異常，引產后行組織檢測發現胎兒患有Turner綜合征。PGS/PGD的取材經歷了從卵母細胞極體到卵裂球到囊胚滋養層細胞的發展過程，通過極體活檢僅能提供母源的遺傳信息，有其局限性；卵裂球活檢僅能提供1～2個卵裂球，且嵌合概率大，影響對胚胎的真實判斷。因此，現在幾乎均為囊胚滋養層活檢。在胚胎發育過程中，內細胞團發育為胎兒，滋養層細胞發育為胎盤部分，活檢不影響胎兒發育，所以此取材部位越來越受推崇。但畢竟胎盤部位的基因結果并不能完全代表胎兒整體，且由以上可知測序技術本身有其局限性。同時也應該充分認識到，PGD/PGS還不是一種很完善的遺傳學檢測技術，其安全性問題有待進一步研究。此外，對于行PGS/PGD技術的子代安全性問題，還需要大樣本的追蹤隨訪。

綜上所述，應用高通量測序技術行胚胎植入前遺傳學檢查，可降低反復流產率及患病胎兒的出生率，提高臨床妊娠率。