氣相色譜法分析啤酒中5種高級醇的方法研究

（長春職業技術學院，吉林長春130033）

啤酒作為一種低酒精度的飲品，因其具有良好的風味、豐富營養及良好的口感而深受消費者喜愛。但是，啤酒存在著飲后出現頭痛、頭暈的現象，造成該現象的主要原因是由于啤酒中高級醇所導致[1－2]。啤酒中高級醇主要包含正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇等[3]，它由原料中糖代謝通過丙酮酸的合成以及發酵過程中氨基酸降解代謝而形成[4－5]。高級醇是啤酒重要風味成分之一，適量的高級醇能促進酒類具有豐滿的香味和口味，并增加酒的協調性。若啤酒中不含或少含高級醇，會使酒味淡薄，酒體不豐滿。然而高級醇過量存在不單是酒主要異雜味的來源之一[6－9]，而且也會對人體產生危害，常常會使人產生頭痛、惡心、嘔吐等，對人體的眼、鼻也有刺激作用，其毒性隨著分子量的增大而增加[10－13]。鑒于高級醇在啤酒中的重要性質，測定啤酒中高級醇的組成和含量，對提高啤酒的質量和風味有很重要的意義。

目前，國外對啤酒中高級醇含量的檢測技術已經比較成熟[14－16]，隨著消費者要求的提高，我國一些啤酒生產企業和研究部門開始注意啤酒中各組分的變化，對高級醇在啤酒中的作用有了初步的認識，認為啤酒中高級醇的適宜范圍在 50 μg/mL～100 μg/mL[17－19]，過低影響口感與風味，過高易引起頭暈。目前測定高級醇含量的方法有頂空進樣－氣質聯用[20－21]、氣相色譜－質譜聯用[22－23]等，但由于設備昂貴，測樣成本高，實驗室儀器設備條件的限制，不能用來進行大批量檢測。分光光度法也可測定啤酒中各種醇的含量，但是測定時間長、準確度不夠、可能產生系統誤差和選擇性不高[24－25]。本試驗擬采用頂空固相微萃取與氣相色譜聯用 （headspacesolid phase microextraction－gas chromatography，HS－SPME/GC）分析技術，采用實驗室一般都有的氣相色譜儀，并通過頂空固相微萃取的條件優化，嘗試建立一種快速、準確、重復性好的檢測啤酒中5種高級醇的方法，為其方法的可推廣性進行驗證。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

正丙醇（99.9%）、正丁醇（99.9%）、異丁醇（99.9%）、正戊醇（99.9%）、異戊醇（99.9%）標準品：美國Sigma公司。

6820氣相色譜儀：美國Agilent公司，配有氫火焰離子化檢測器；Oasis固相萃取頭：美國Supelco公司。

1.2 方法

1.2.1 氣相色譜條件

進樣口溫度250℃；升溫程序：初始溫度50℃，保持2 min，以5℃/min升至120℃，保持3 min，然后以10℃/min升至240℃，保持5 min，最后以15℃/min升至270℃，保持10 min；進樣方式：分流比10∶1；載氣：高純氮氣；空氣：400 mL/min；氫氣：30 mL/min；流速為0.8 mL/min。

1.2.2 萃取條件的優化

將萃取頭插入氣相色譜（gas chromatography，GC）進樣口中，于250℃老化2h。稱取2mL樣品超聲5 min趕去啤酒中的氣泡后，置于10 mL頂空進樣瓶瓶中，插入萃取頭，于不同的萃取溫度下頂空萃取一段時間，于250℃解析5.0 min。分別比較不同的萃取頭、萃取溫度以及萃取時間對樣品中高級醇成分萃取效果的影響。

1.3 樣品分析

將啤酒樣品按氣相色譜條件進行測定。采用保留時間及標準添加法定性，外標法定量。

2 結果與討論

2.1 色譜柱的選擇

本試驗比較了 HP－5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、TG－35MS（30 m×0.25 mm×0.5 μm）、TG－WAXMS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）這3款不同的色譜柱。結果發現TG－WAXMS色譜柱進行5種高級醇的分析色譜圖效果較好，能夠很好的分離各高級醇，并且具有良好的靈敏度，能夠滿足檢測的需要。

2.2 色譜條件的優化

分別設置不同的柱初始溫度（40、50、60、70℃）、分流比（5∶1、10∶1、20∶1、40∶1）以及載氣流速（0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min），考察其對被測5種組分分離度的影響，結果見圖1。

圖1 5種高級醇標準品的色譜圖Fig.1 Chromatograms of 5 kinds of higher alcohol standard products

結果表明：當柱初始溫度為60℃，分流比為10∶1，載氣流速為0.8 mL/min時，5種高級醇的分離效果較好，具有較高的準確度。

2.3 固相微萃取頭的選擇

由于不同材質的固相微萃取頭對啤酒中高級醇的萃取效果不同，因此不同類型的固相微萃取頭的選擇會影響到目標物的萃取效果。本試驗選擇并比較了4種較常見的固相微萃取頭的萃取效果：85 μm聚丙烯酸酯 （polyacrylate，PA）、100 μm 聚二甲基硅氧烷（polydimethylsil－oxane，PDMS）、65 μm 聚二甲基硅氧烷（PDMS）/二乙烯苯（divinylbenzene，DVB）以及 50/30 μm 二乙烯苯（DVB）/聚乙二醇（Carbowax）/聚二甲基硅氧烷（PDMS），萃取效果的比較見圖2。

圖2 4種萃取頭的萃取效果比較Fig.2 Extraction efficiencies of four solid phase microextraction fibers

由圖2可知，不同類型的固相微萃取頭對啤酒樣品中5種高級醇萃取效果有很大影響。萃取頭的萃取效果主要受萃取頭涂層極性與表面積的影響。非極性涂層可有效萃取非極性化合物，極性涂層可有效萃取極性化合物。PA、PDMS對非極性化合物萃取效果較好，而Carbowax和DVB更適用于偏極性化合物的萃取。所以本實驗選擇的4種萃取頭中，100 μm PDMS偏非極性的固相微萃取頭對5種高級醇的萃取效果更 好，其次是 85 μm PA、50/30 μm DVB/Carbowax/PDMS 和 65 μm PDMS/DVB。因此選取 100 μm PDMS萃取頭作為此次啤酒中高級醇萃取試驗的萃取頭。

2.4 萃取溫度的選擇

溫度對固相微萃取頭的萃取效果有雙重影響，溫度升高時，有利于高級醇的擴散，縮短了萃取的時間，但是溫度的升高也會使目標物在萃取頭的涂層中分配系數降低，導致吸附量減小，影響萃取頭的靈敏度。在萃取時間為60 min時，分別比較了100 μm PDMS萃取頭在40、50、60、70℃下對上述5種高級醇的萃取效果，結果見圖3。

圖3 萃取溫度對高級醇組分吸附的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the adsorption of higher alcohol components

結果如圖3所示，50℃條件下的萃取頭對高級醇的吸附量最大，說明在此溫度下的萃取效果最佳。萃取溫度在40℃時，較低溫度會導致目標物揮發的速度較慢或不完全揮發；而溫度至60℃以上時，萃取頭對高級醇的吸附量均有不同程度的減小，可能是由于目標物隨著溫度升高在萃取頭涂層中吸附量下降所致。綜合考慮，實驗選擇將50℃作為試驗固相微萃取頭的萃取溫度。

2.5 萃取時間的選擇

比較分析不同萃取的時間對5種高級醇萃取效果的影響，結果見圖4。

圖4 萃取時間對高級醇組分吸附的影響Fig.4 Effect of extraction time on the adsorption of higher alcohol components

結果如圖4，隨著萃取時間的增加，萃取頭對高級醇的吸附量明顯增加；當萃取時間超過40 min后，萃取頭對高級醇的吸附量均有不同程度下。因此，選擇40 min作為試驗固相微萃取頭的萃取時間。

2.6 啤酒中5種高級醇的定量分析

試驗配制了濃度為 0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/mL 的系列5種高級醇的混合標準溶液上機進行檢測。結果發現這5種高級醇的線性關系都符合標準，詳細結果見表1。

表1 5種高級醇的出峰時間、方程曲線、關聯系數、檢出限、定量限Table 1 Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of 5 kinds of higher alcohol

試驗結果表明，5種高級醇在0.1 mg/mL～5.0 mg/mL內均具有良好的線性關系（r2＞0.999），并得到5種目標組分的檢出限0.002 mg/mL～0.007 mg/mL，相對標準偏差范圍為2.69%～4.22%。

2.7 加標回收與相對偏差試驗

分別添加0.2、1.0、2.0 mg/mL等3個梯度濃度的高級醇混合溶液到啤酒樣品中，測定結果見表2。

表2 回收率及方法的相對標準偏差Table 2 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method

由表2可見，5種組分的3個水平的加標回收率為89.6%～95.9%，相對標準偏差（RSD）為2.4%～5.3%，表明本試驗所建立的方法能夠滿足檢測實際樣品需要的靈敏度、精密度和準確度，可以用于啤酒樣品中高級醇的分析檢測。

2.8 樣品中目標物的測定

按照上面確定的測定方法，對5種市售啤酒進行氣相色譜分析外標法定量，結果見表3。

表3 啤酒樣品測定結果Table 3 Determination of beers

從表3可以看出，5種啤酒成品高級醇含量均未超過其風味閾值，各組分含量適中，賦予了啤酒芳香的口味和酒體的醇厚感，圖5為其中一款樣品分析高級醇的氣相色譜圖。

圖5 啤酒樣品中高級醇的色譜圖Fig.5 Chromatograms of higher alcohols in beer samples

3 結論

本文建立了HS－SPME/GC分析啤酒中5種高級醇的方法。針對樣品中5種組分的極性性質，實驗選擇100 μm PDMS固相微萃取頭，50℃頂空萃取40 min。5種高級醇的分離采用TG－WAXMS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）色譜柱，在 0.1 mg/mL～5.0 mg/mL 內均具有良好的線性關系（r2＞0.999），5種目標組分的檢出限范圍為0.002 mg/mL～0.007 mg/mL，加標回收率范圍為89.6%～95.9%，相對標準偏差（RSD）為2.0%～4.3%。通過GC對4種啤酒樣品中的高級醇含量檢測，發現均未超過其風味閾值，各組分含量適中，賦予了啤酒芳香的口味和酒體的醇厚感。本試驗建立的方法，可對啤酒中高級醇進行分析和測定，有助于提高檢測實驗室的分析此類樣品的效率，在實驗室的推廣可行性較高，旨在為啤酒行業的質量改進提供試驗依據。