核仁蛋白RRP15在細胞有絲分裂期的表達與定位

陳超敏 ，楊 佳 ，董智雄 ，3，朱長軍 ，3

（1.天津師范大學 生命科學學院，天津 300387；2.天津師范大學 天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387；3.天津師范大學 分子細胞系統生物學重點實驗室，天津 300387）

細胞增殖過程又稱為細胞周期，是細胞生命活動的重要特征之一.細胞周期是從一次細胞分裂結束開始，經過物質準備，直到下一次細胞分裂結束為止.細胞周期分為DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）和有絲分裂期（M期）[1-3].細胞有絲分裂期又可分為前期、前中期、中期、后期和末期.細胞周期是一個十分復雜而又精確的生命過程，多種蛋白參與細胞周期的精確調控，使其能夠正確運行，而任何環節的異常都可能導致細胞死亡或細胞周期調控紊亂，最終引起細胞惡性增殖和腫瘤[4-6].核仁（nucleolus）是真核細胞內無定型的亞細胞器結構[7-8]，是細胞內核糖體生物發生的場所[9-10].核糖體是細胞內蛋白翻譯的唯一細胞器，因此核仁的結構與功能與細胞增殖密切相關[11].近年來大量研究表明，核仁及核糖體相關蛋白在細胞應激反應過程中發揮著重要作用，在多種內外條件的刺激下（如營養缺乏、DNA損傷和活性氧自由基ROS的積累），細胞產生應激反應，導致核糖體發生生物學變化[12-13]，即產生核糖體壓力.核糖體壓力應答通路參與維持細胞的穩態和基因組穩定[14-16]，該應答通路的異常，包括參與其中的各種蛋白質結構、定位及功能的異常，都將引起細胞增殖和功能異常，最終導致多種疾病特別是腫瘤的發生與發展[14，17].

核糖體RNA加工蛋白15（ribosome RNA processing protein 15，RRP15）是一個在進化中高度保守的蛋白質，其蛋白結構中部含有一個coiled-coil結構域，N端和C端沒有特異結構域.據報道，在酵母中，RRP15參與核糖體60S大亞基的生物發生[18]；在小鼠中，RRP15可以調節細胞增殖和細胞凋亡，并在核糖體RNA加工中發揮重要作用[19].本課題組前期研究發現，RRP15蛋白在細胞周期有絲分裂間期定位于核仁，并且在保持核仁結構完整、核糖體生物發生以及細胞增殖等細胞生命活動中發揮重要調控作用[17，19]，但RRP15在有絲分裂期的功能仍不清楚.已知在細胞有絲分裂前期核仁發生解體，RRP15的亞細胞定位必然發生變化.RRP15蛋白在細胞周期不同時期的表達、亞細胞定位及其具體功能尚未見報道.

本研究以能夠穩定表達GFP-RRP15的HeLa細胞為材料，通過細胞同步化、蛋白免疫印跡、免疫熒光染色、活細胞成像和染色體提取等方法，研究了RRP15在細胞周期不同時期的表達情況、亞細胞定位及其與有絲分裂期細胞染色體的關系，希望能夠為進一步研究RRP15蛋白在細胞有絲分裂期的功能、探討RRP15與腫瘤發生發展的關系以及將RRP15作為腫瘤治療的潛在靶點提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

人宮頸癌細胞株HeLa、pEGFP-RRP15質粒為天津師范大學分子細胞系統生物學重點實驗室所有[17].

1.1.2 試劑

DMEM培養基，美國Gibco公司；胎牛血清，美國Hyclone公司；Lipofectamine 3000、熒光標記或辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗和DAPI，美國Invitrogen公司；特異性單克隆鼠抗α-Tubulin抗體、GFP抗體，美國 Sigma公司；RNA 酶（RNase）、DNA 酶（DNase），美國Takara公司；新霉素（G418），德國Calbiochem公司；特異性多克隆兔抗RRP15抗體、特異性多克隆兔抗PRC1抗體，本課題組自制.

1.1.3 儀器

蛋白電泳儀，美國Bio-Rad公司；Nikon TS-100 FL倒置熒光顯微鏡和Nikon 90i共聚焦熒光顯微鏡，日本Nikon公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及傳代

HeLa細胞用含有10%（體積分數）胎牛血清的DMEM培養基在細胞培養箱中（溫度為37℃，CO2體積分數為5%）培養，每周傳代2～3次，傳代時先用胰酶消化細胞，擴增細胞至新鮮培養基中.

1.2.2 細胞同步化實驗

采用雙胸腺嘧啶核苷（double-thymidine）阻滯法將HeLa細胞阻滯于G1/S期.在對數生長期的HeLa細胞中加入終濃度為2 mmol/L的胸腺嘧啶核苷（thymidine），培養16～18 h.將細胞釋放至新鮮培養基中培養12 h，然后再次加入終濃度為2 mmol/L的胸腺嘧啶核苷，繼續培養12 h.最后釋放細胞至新鮮培養基中，每隔2 h收集一次細胞，直至24 h.將收集的細胞用體積分數為70%的冰乙醇溶液固定或裂解后保存在-20℃冰箱內，分別通過流式細胞術和蛋白印跡雜交法進行檢測分析.

1.2.3 流式細胞術

將同步化收集固定的細胞離心去除乙醇，用PBS洗滌 2次.加入 0.5 mL 的碘化丙啶（PI）染色液（50 μg/mL PI+100 mg/L RNase），37℃下避光放置30 min.應用Facsort流式細胞儀對細胞內的DNA含量進行檢測，使用CellQuest軟件分析細胞周期的分布狀況.

1.2.4 蛋白免疫印跡雜交（Western blot）

收集細胞，使用1×SDS蛋白上樣緩沖液進行裂解.將細胞裂解液進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，其后轉膜至PVDF膜.用含有脫脂奶粉（質量分數為5%）的TBS緩沖液室溫封閉30 min，隨后經室溫一抗孵育2 h，二抗孵育1 h，最后加ECL顯色液，在暗室內曝光檢測PVDF膜上的蛋白.

1.2.5 細胞免疫熒光（immunofluorescence，IF）

在細胞爬片上培養HeLa細胞，取出爬片后PBS洗3次，用500 μL的福爾馬林固定液固定細胞15 min，用含有甘氨酸（濃度為0.1 mol/L）的PBS終止固定反應.加入封閉液室溫封閉30 min，棄去封閉液，用含有Triton X-100（質量分數為0.1%）的PBS洗3次.隨后加一抗室溫孵育2 h，熒光標記的二抗室溫避光孵育1h，加1μg/mL的DAPI染色3min.最后封片，鏡檢.

1.2.6 細胞轉染

在24孔板中接種5×104個HeLa細胞，CO2培養箱中培養24 h.按照產品說明書，應用Lipofectamine 3000轉染試劑將質粒pEGFP-RRP15轉入細胞中，繼續培養24 h，熒光顯微鏡下觀察轉染效率.

1.2.7 G418篩選

細胞轉染24 h后，用胰酶進行消化，收集細胞計數.轉1 000個細胞至直徑為10 cm的細胞培養皿中，每皿加入含有G418（質量濃度為1 g/L）的DMEM培養基，每5 d更換新鮮的含G418的DMEM培養基繼續培養.10 d后在倒置熒光顯微鏡下挑取熒光細胞克隆，置于24孔板中，待細胞生長擴增后轉入直徑為10 cm的培養皿中繼續培養.

1.2.8 活細胞成像實驗（living cell imaging）

將穩定表達GFP-RRP15的細胞接種于玻璃底細胞培養皿中，在活細胞成像系統中進行培養.應用熒光顯微鏡觀察記錄細胞內熒光蛋白的變化，每2 min拍照一次，連續拍攝24 h.

1.2.9 染色體提取實驗（chromosome spreading）

在含有秋水仙素（質量濃度為0.1 μg/mL）的DMEM中培養HeLa細胞18 h，收集培養皿中懸浮的有絲分裂期細胞，置于冰上.用冰冷的PBS洗3次，再次離心收集.加入含有KCl（濃度為60 mmol/L）的PBS，37℃下放置30 min，短暫離心.應用固定緩沖液（甲醇和乙酸的體積比為3∶1）將細胞冰上固定15 min，短暫離心.用2 mL固定buffer重懸細胞，從高處將細胞滴到載玻片上，隨后將細胞在含有DNase I（1 U/μL）的PBS中37℃下孵育20 min，對照組不含DNaseI.再用含有RNase（質量濃度為100μg/mL）的PBS在37℃下孵育20 min.用PBS洗3次，每次5 min.隨后室溫一抗孵育2 h，二抗避光孵育1 h，質量濃度為1 μg/mL的DAPI染色3 min.在載玻片上滴加4 μL的抗淬滅劑，封片，鏡檢.

2 結果與分析

2.1 RRP15在細胞周期不同時期的表達

采用Double-thymidine阻滯法對HeLa細胞進行同步化處理，在不同時間收集細胞后，用流式細胞術分析細胞周期分布狀況，用Western blot檢測RRP15在細胞周期不同時期的表達水平，結果如圖1所示.

圖1（a）中的流式細胞術分析結果表明，HeLa細胞同步化較好，在0 h所有細胞均集中在G1/S期，其后隨著釋放時間的推移，進入HS期，并在6～8 h時進入G2/M期，在10 h重新進入G1期.由圖1（b）可以看出，PRC1（protein regulate cytokinesis 1）蛋白主要在6～8 h的細胞中表達，該蛋白是一個參與調控細胞有絲分裂及胞質分裂的微管結合蛋白，在G2/M期高表達.RRP15蛋白在細胞周期的不同時期均有表達，且在10～24 h的細胞中表達微量上調.

圖1 RRP15在細胞周期不同時期的表達Fig.1 Expression of RRP15 during cell cycle

2.2 RRP15在細胞有絲分裂期的亞細胞定位

RRP15在整個細胞周期中均有表達，預示它在細胞周期的各個時期都發揮著不可或缺的功能.利用純化的RRP15抗體對細胞進行免疫熒光染色實驗，結果如圖2（a）所示.為了進一步直觀觀察RRP15在細胞生長周期不同時期的定位，進行活細胞成像實驗，結果如圖2（b）所示.

由圖2（a）可以看出：RRP15在間期細胞中主要定位于核仁；在核基質和細胞質中也有少量定位.而在有絲分裂期，RRP15的細胞定位始終伴隨著染色體的行為而變化：前期核膜尚未破裂，RRP15仍主要定位于核仁部位；進入前中期后，核膜破裂，核仁消失，RRP15散布在整個細胞中，并在染色體周圍定位較多；中期RRP15隨著染色體排列而集中在赤道板附近；后期RRP15仍集中在染色體附近；在末期，RRP15出現多個點狀集中區域（藍箭頭所示），可能為重新組裝的核仁結構；當核膜形成，核仁重新出現時，RRP15重新定位于核仁中.除此之外，RRP15在有絲分裂末期的中小體結構處也觀察到少量定位（黃箭頭所示）.由圖2（b）可以看出：GFP-RRP15在有絲分裂間期也主要定位于核仁部位，這與內源性染色結果一致；而在有絲分裂期，GFP-RRP15始終伴隨著染色體；在末期，除主要定位于重新裝配的核仁部位外，在中小體部位也存在少量GFP-RRP15定位（紅箭頭所示）.總的來看，RRP15在有絲分裂期是一個染色體伴侶蛋白，始終伴隨染色體定位.

圖2 RRP15在細胞有絲分裂期的亞細胞定位Fig.2 RRP15 subcellular localization in mitosis

2.3 RRP15與染色體的關系

細胞免疫熒光染色實驗和活細胞成像實驗顯示，RRP15在有絲分裂期伴隨在染色體外周.為了進一步確認RRP15與染色體的關系，利用染色體提取制備方法分離有絲分裂中期細胞的染色體，并通過免疫熒光觀察RRP15與染色體的關系，結果如圖3（a）所示.將純化的染色體經RRP15抗體和DAPI染色，發現RRP15與DNA存在明顯的共定位，由此證實RRP15定位于分離的有絲分裂期染色體上.RRP15可能通過與DNA直接作用結合在染色體上，也可以通過與染色體上其他蛋白的相互作用定位至染色體.為了進一步分析RRP15的染色體定位機制，再次進行了染色體提前制備實驗，并對實驗操作步驟做了修改.將染色體從細胞中分離到載玻片上后，首先用DNase處理消化DNA，然后再進行固定，染色.通過免疫熒光染色實驗檢測DNase處理后RRP15蛋白定位的變化.如果RRP15為DNA結合蛋白，則消化DNA后RRP15也將從染色體上脫落，無法觀察到RRP15的染色；若RRP15為染色體外周蛋白，消化DNA則不會影響RRP15的定位，最后仍可觀察到RRP15染色.實驗結果如圖 3（b）所示.由圖 3（b）可以看出，DNase處理引起染色體DNA的染色明顯下降，但RRP15的染色體外周染色并沒有顯著變化.這表明RRP15在有絲分裂期定位于染色體但不依賴于染色體DNA，而是通過其他機制定位于染色體外周.

圖3 RRP15與染色體的關系Fig.3 Relationship of RRP15 with chromosome

3 討論與分析

核糖體RNA加工蛋白RRP15已被證實是核仁定位蛋白，與核仁的形成、核糖體的生物發生以及細胞生長增殖密切相關[17].本研究明確了RRP15在細胞周期不同時期的表達情況和亞細胞定位，證實RRP15在整個細胞周期中均有穩定表達，且在G1期表達微量上調.RRP15在細胞有絲分裂間期的定位與功能研究已經較為明確.前期研究[17]表明，RRP15在間期定位于核仁，并且在控制核仁形成、核糖體生物發生和細胞增殖方面發揮重要的調控作用，但是RRP15在有絲分裂期的定位與功能仍然是未知的.本研究通過細胞免疫熒光染色、活細胞成像技術及有絲分裂中期染色體提取染色等實驗確定了在有絲分裂期RRP15的定位伴隨著染色體，并且在有絲分裂末期有少量定位于中小體部位.RRP15在有絲分裂期是一個染色體外周蛋白，其染色體外周定位不依賴于染色體DNA.這一結果表明，RRP15在有絲分裂期作為染色體外周蛋白，可能發揮著保護和維持細胞有絲分裂期染色體結構的功能，在有絲分裂期細胞染色體的整列與分離過程中發揮潛在作用，最終參與調控細胞基因組的穩定性[20-21].

綜上所述，本研究結果為探討RRP15在細胞有絲分裂期的功能提供了細胞表型基礎，并為探究染色體外周蛋白的定位提供了新的技術方法.在后續研究中，本課題組會進一步探討將細胞內RRP15過表達或敲除后有絲分裂期染色體整列與分離以及有絲分裂紡錘體形成與功能的異常等，最終明確RRP15在細胞有絲分裂期的具體作用.