2016年山東地區10株H9N2亞型禽流感病毒HA基因的遺傳演化分析

邵明辰，王友令

（1.山東魯南牧工商有限公司，山東 滕州 277500；2.山東省農業科學院家禽研究所，山東 濟南 250100）

禽流感(AI)由A型禽流感病毒引發的高度接觸性傳染病，它不但能造成養禽業的巨大經濟損失，還對人類公共衛生安全構成威脅[1]。禽類感染禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)后，癥狀可表現為非顯性感染、亞臨診感染，或輕度呼吸道疾病，產蛋量下降直至急性全身致死性疾病等多種形式。禽流感病毒屬于正粘病毒科、流感病毒屬的A型流感病毒，為分節段的、單股、負鏈 RNA病毒，每個RNA片段都是由核蛋白包被形成RNPs復合體，RNPs是由基質蛋白(M)構成完整的膜包裹[2]。雖然家禽感染低致病性AIV的發病率、死亡率低，但可引起產蛋量下降，造成免疫抑制，造成養禽業巨大的經濟損失。

H9N2禽流感病毒呈世界性分布，其按地區可分為北美和歐亞兩個種系[3]。我國于1994年首次公開報道，但未波及全國[4]。HA基因是A型流感病毒致病性的主要影響因子,主要通過HA識別宿主細胞的特異性受體，從而吸附于細胞表面，以吞噬小體的形式進入細胞質，膜融合后釋放病毒的RNP[5]。HA蛋白識別受體結合位點是感染的第一步，也是比較關鍵的一步。HA蛋白能識別兩種類型的受體，分別為α-2，3-半乳糖和α-2，6-半乳糖連接的唾液酸[6]。

為了解2016年山東地區H9N2亞型禽流感病毒HA基因的變異情況及探討其是否發生了重組，特選取所分離的10個H9N2亞型禽流感病毒分離株，對其HA基因進行測序，分析其遺傳演化規律，為山東地區H9N2禽流感的防控提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 毒株 10株H9N2亞型禽流感病毒流行株由山東省農業科學院家禽研究所按照參考文獻中的方法進行分離、鑒定及純化[1]。其毒株代表號依次為 A-CK-SD-XT31-2016-H9N2、A-CK-SD-XT33-2016-H9N2、A-CK-SD-XT34-2016-H9N2、A-CKSD-XT35-2016-H9N2、A-CK-SD-XT39-2016-H9N2、A-CK-SD-XT43-2016-H9N2、A-CK-SDXT44-2016-H9N2、A-CK-SD-XT46-2016-H9N2、ACK-SD-MHS3-2016-H9N2、A-CK-SD-MHS5-2016-H9N2。

1.2 主要試劑 SPF雞和雞胚均由山東省農業科學院家禽研究所SPF雞研究中心提供。Trizol、DNA回收試劑盒、質粒提取試劑盒、pMD18-T Vector、限制性內切酶和一步法RT-PCR試劑盒均購自大連寶生物有限公司。

1.3 引物合成 參考GenBank上已發表的H9N2亞型禽流感病毒HA基因序列，利用Oligo6.0軟件設計了一對引物，由上海生工生物工程有限公司合成，用于擴增HA基因全長序列。

H9上游引物(H9F)∶

5＇-CACCATGGAAACAATATATCACTAMT-3＇；

H9下游引物(H9R)∶

5＇-CTATATACAAATGTTGCRYCT-3＇。

引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。預期擴增的HA基因大小為1687bp，編碼560個氨基酸。

1.4 擴增 病毒RNA的提取及HA基因的RTPCR擴增按照Trizol試劑盒說明書提取病毒RNA，取適量DEPC處理的超純水溶解RNA。RTPCR采用大連寶生物工程有限公司的一步法提取試劑盒說明書進行操作。

1.5 PCR產物的克隆與序列分析 將PCR產物克隆測序，拼接所得HA基因序列，并結合GenBank上已發表的8株H9N2禽流感病毒株的HA基因序列（毒株具體信息及登錄號詳見表1），用MEGA5.0分別對其進行遺傳演化分析，繪制系統進化發育樹，從而對上述毒株的HA、NA基因分子遺傳變異情況進行分析。

表1 下載毒株的基本信息及登錄號

2 結果與分析

2.1 HA基因遺傳分析 用 MEGA5.0對參考序列和本實驗所得10個H9N2病毒分離株HA基因進行遺傳演化分析，得到的進化樹見圖1。

10株H9N2亞型AIV的HA基因的cDNA全序列，全長1742bp，ORF全長為1683個核苷酸，位置為34～1716位核苷酸，編碼560個氨基酸。將10個分離株與GenBank上發表的參考毒株進行核苷酸序列和氨基酸序列的同源性比較，10個分離株與BJ94參考毒株HA基因的核苷酸之間的同源性為89.1%～91.3%，氨基酸之間的同源性為90.0%～93.4%；與 A/chicken/Zhejiang/HJ/2007（G57分支）參考毒株HA基因的核苷酸之間的同源性為89.1%～91.3%，氨基酸之間的同源性為93.6%～97.0%；而分離株之間的HA基因核苷酸同源性為94.1%～99.8%，氨基酸序列之間的同源性為94.3%～100%。

所有分離株的HA裂解位點均為RSSR↓GLF，有 6～8個潛在的糖基化位點（N-X-T/S，X 為除 P外的氨基酸），XT39毒株在 218～220位和313～315位出現糖基化位點雙缺失，XT205和XT208毒株在218～220位糖基化位點缺失，XT33和MHS3毒株在551～553位潛在糖基化位點缺失。10株分離株構成HA唾液酸受體結合位點的氨基酸在191位非常保守，為N（天冬酰胺），與經典的禽流感國內分離株一致。10株分離株中有3株在198位上變異為A （丙氨酸），6株變異為T（蘇氨酸），1株變異為M（甲硫氨酸）三種形式。10株分離毒在234位受體結合位點均為L（亮氨酸），具有與哺乳動物唾液酸a，2-6受體結合的特征，該類毒株的流行在公共衛生上應值得重視。從進化樹分析可知，10個分離株同屬于歐亞分支中的A/Chicken/Beijing/1/1994(A/Duck/Hong-Kong/Y280/97)亞群，與近年在中國的雞群中流行的由A/chicken/Zhejiang/HJ/2007為代表的新的基因型(G57分支)遺傳關系最近[7]，推測是由其進化演變而來。

圖1 10個H9N2病毒分離株HA基因進行遺傳演化分析進化樹

3 討論

HA基因是A型流感病毒致病性的主要影響因子。HA裂解位點氨基酸序列是決定禽流感病毒致病性和毒力強弱的關鍵因素之一。HA蛋白識別受體結合位點是感染的第一步，也是比較關鍵的一步。本研究中10個毒株HA基因裂解位點氨基酸序列為RSSR↓GLF，不存在多個連續堿性氨基酸插入，具有低致病性病毒分子特征。Steinhauer[8]發現流感病毒表面血凝素HA蛋白上第183、190和226位氨基酸是關鍵的受體結合位點，與病毒的受體結合特性和宿主特性相關。本研究中10個毒株HA受體結合位點的第149、198、234位氨基酸也存在變異。10個毒株有6～8個潛在的糖基化位點，10株分離株構成HA唾液酸受體結合位點的氨基酸在191位非常保守，為N（天冬酰胺），與經典的禽流感國內分離株一致。10株分離株中有3株在198位上變異為A （丙氨酸），6株變異為T（蘇氨酸），1株變異為M（甲硫氨酸）三種形式。另外有9株病毒在313位氨基酸處出現了一個新的潛在的糖基化位點。新增糖基化位點的出現可能改變病毒的抗原性并影響受體結合特性而感染新的宿主。

Sun等[9]對2003～2008年6年間中國北方不同地區的22株禽源和豬源H9N2毒株分析后也發現，同一時期不同地區病毒株之間同源性較高，但較早期病毒均有不同程度的變異和進化。楊婧等[10]對2005年以后的H9N2HA和NA基因同源性關系研究發現，H9N2HA和NA基因的變異情況與地域無相關性，與時間呈一定的相關性。由此表明，H9N2發生變異與時間呈現一定的相關性，與地域無關。本研究中，從進化樹分析可知，10株H9N2分離毒HA基因呈現出與分離時間相近的同源性關系。

H9N2禽流感病毒在亞洲普遍存在，由于較低的致病性，對人類健康產生的威脅也較低，致使公眾的警惕性不高[11]。Butt等[12]發現2003年香港感染人類的H9N2禽流感毒株A/Human/Hong Kong/2108/03其HA蛋白的226位即為亮氨酸(L)，而從家禽體內分離到的H9N2禽流感毒株A/Gf/Hong Kong/nt184/03其HA蛋白的226位則為谷氨酸(Q)。本研究中，10株H9N2禽流感病毒的226位氨基酸，均為亮氨酸(L)，呈現出典型的人流感受體結合特性。由此表明2016年山東地區H9N2具有對哺乳動物的感染性有增高的趨勢，易感染人類，有一定的公共衛生危害，因此需要提高對其的重視度。另外還需提防H9N2與其他流感病毒的重組或者抗原漂移現象，以防制造出新流感病毒的風險。已有研究報道證實感染人的H5N2、H10N8、H7N9的6個內部基因均來自H9N2亞型禽流感病毒[13]。綜上所述，應該加強重視低致病性的H9N2亞型禽流感病毒，防止其打破原有的種間屏障直接傳播給人類和低等哺乳動物，以進一步降低其公共危害。