一例雞新城疫病RT-P C R的診斷*

張文通 ，魏鳳 ，李峰 ，王金良 ，苗立中 ，沈志強 ，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600）

雞新城疫(Newcastle disease，ND)是由副粘病毒引起的禽類的高度接觸性傳染病。該病呈世界性分布，又稱為亞洲雞瘟[1-3]。以高度呼吸困難、便稀、神經紊亂、粘膜和漿膜出血為主要特征[1-3]，具有較高的發病率和致死率，對養雞業危害嚴重。2018年4月，山東博興縣某雞場發生了以呼吸困難、拉綠色糞便及腺胃出血等特征的疑似雞新城疫疾病，現將診治療過程報告如下：

采用發病情況調查、臨床癥狀、病理剖檢、病原分離、RT-PCR診斷，確診病原為雞新城疫病毒。根據確診結果，按照雞新城疫病防治措施操作，雞場發病情況立即得到好轉。

1 發病情況

2018年4月初發現濱州博興縣某規?；半u場（存欄約1萬只）有雛雞（2～3周齡）開始零星發病，兩三天波及全群，發病率達100%，病死率約30%。用抗生素治療無效。

2 臨床癥狀

呼吸困難，嗜睡，臥倒，拉綠色稀糞便；個別雛雞臨死前有神經癥狀。

3 病理變化

剖檢病死雞，結果發現：氣管有粘液，肺臟出血，肝臟出血、腺胃乳頭出血、淋巴結腫大出血，小腸出血。

4 病毒分離鑒定

4.1 病料采集 無菌取病死雞肺臟、脾臟、淋巴結等。

4.2 病料處理 將采集的樣品，按照樣品與滅菌0.85%生理鹽水 1∶3比例研磨；反復凍融；4℃12000r/min離心10min；吸取上清，將上清液用0.22μm一次性濾器過濾除菌；分裝凍存于-80℃備用。

4.3 病毒分離 用上述過濾除菌病料尿囊腔內接種10日齡SPF雞胚10枚，每胚0.1ml，置36～37℃繼續孵育。孵育結果為，24h內無死胚，收獲接種后24～120h死胚尿囊液，分裝。繼續在SPF雞胚上傳至3代，并收獲尿囊液備檢。

5 病毒的RT-PCR鑒定

5.1 引物設計 根據GenBank報道的“KF306265”序列設計，擴增長度522bp，用于鑒定雞新城疫病毒。引物序列如下：

上游引物：ATGGGCTCCAGACCTTCTACT；

下游引物：TTGTGATAATCCGTCGGTGA。

5.2 病毒的RT-PCR 提取3代胚尿囊液的RNA，并同時提取新城疫陰性胚毒及新城疫陽性胚毒的RNA（新城疫陰性、陽性胚毒來自山東綠都生物科技有限公司）。病毒RNA用大連寶生物提供的RNA提取試劑盒提取，一步法RT-PCR反應成分及反應程序見表1。

表1 RT-PCR反應體系

RT-PCR反應條件為：50℃反轉錄45min；94℃5min； 進 入 PCR 循 環 ，94℃ 45Sec，55℃ 45Sec，72℃ 45Sec，30個循環后，72℃延伸 10min。 反應結束后，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。

5.3 病毒的RT-PCR鑒定結果 瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，病毒的RT-PCR擴增產物大小約522bp，與預期一致，見圖1所示。

圖1 病毒的RT-PCR擴增產物

回收RT-PCR產物，送往上海生物工程有限公司測序。測序結果與GenBank上報道的雞新城疫核苷酸序列同源性最高達99%。

5.4 治療措施 經上述診斷確認病原為雞新城疫病毒。建議雞場采取如下措施：①消毒及隔離措施。建議對發病雞舍與受威脅雞舍采取嚴格隔離措施，并進行全面、定期消毒；②緊急接種措施。購買正規廠家的新城疫疫苗，對本場所有雞群進行緊急免疫；③無害化處理措施。對病死雞，進行深埋或其他無害化處理措施；④藥物輔助治療措施。建議對所有雞群采用對大腸桿菌敏感的抗生素進行預防或治療，并給予Vc等藥物用于提高機體免疫力。

養雞場按照上述治療措施進行操作，發病雞群死亡率及發病率大幅降低。2周后病情基本緩解，雞場進入穩定狀態。

6 小結

通過與發病雞場廠長進行溝通，該場進行過新城疫疫苗免疫。但免疫之前，未進行母源抗體測定，按經驗進行免疫接種。另外該場生物安全措施幾乎沒有，人員未經消毒隨意進入雞舍，總之管理混亂。雞舍內部未定期消毒，雞舍環境較差。這三點可能是該場暴發雞新城疫病的原因。